Bột rong B.gelatinus (xử lý) Lọc Dịch chiết Định mức 50mL
Tủa cồn tuyệt đối Tỉ lệ Vcồn : Vdịch = 4 : 1
Chiết
Tỉ lệ rong: nước=1/20(35,50) Nhiệt độ chiết: 600c, 800c, 1000c
Thời gian chiết: 30’, 105’, 180’
Bã
Sấy
Cân Lấy 10mL
Ly tâm lấy tủa, rửa tủa bằng cồn 850 ,960 nhiều lần Hịa tan tủa, thẩm tách
Đơng khơ
Sulfate polysaccharide
Hình PLA2.3. Hình ảnh cân và chiết carrageenan nguội từ rong Đỏ
B.gelatinus tại phịng thí nghiệm Hóa phân tích – Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang.
2.2.2. Chiết carrageenan bằng phương pháp xử lý kiềm
Rong được xử lý với NaOH 0,5 Mol/l trong 12 giờ tại nhiệt độ phòng. Hỗn hợp được lọc và ly tâm loại bỏ phần cặn nổi trên. Dịch lọc được chỉnh về pH=3 bằng dung dịch HCl, ly tâm loại tủa, dung dịch được tủa bằng ancol 80% để qua đêm, rửa tủa 3 lần bằng ancol, sấy tủa thu được SP.
Hình PLA2.4. Chiết carrageenan bằng phương pháp xử lý kiềm.
Bột rong B.gelatinus
Xử lý với NaOH 0,5 mol/l, trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng
Lọc, ly tâm
Dịch lọc
Chỉnh về pH=3 bằng dung dịch HCl
Ly tâm
Dung dịch được tủa bằng ancol 80% để qua đêm
Rửa tủa 3 lần bằng ancol
Sulfate polysaccharide Cặn
Loại tủa
2.2.3. Phương pháp chiết carrageenan bằng NaHCO3(chiết tự nhiên)
- Cân 1gam NaHCO3 cho vào bình định mức 250mL, thêm nước vào đến vạch 250mL ta được dung dịch NaHCO3 có nồng độ 0,05M
- Lấy 200mL dung dịch NaHCO3 0,05M cho vào 10g mẫu rong, đun trên bếp điện với nhiệt độ cố định ở 90oC liên tục khoảng trong 2 giờ. Quá trình chiết được tiến hành bằng việc bổ sung thêm nước. Sau đó lọc nóng thu lấy dịch bằng vải lọc, vắt kiệt lượng dịch còn lại trong rong và lọc lại 2-3 lần thu được dịch lọc có màu vàng nâu. Cô cạn dung dịch lọc trên bếp điện khoảng cịn ½ thể tích cho keo. Dịch lọc được để nguội hẳn thì đơng cứng như đông sương. Cho cồn tuyệt đối vào tủa với tỉ lệ mẫu: cồn là 1:5; bóp kết tủa thật mạnh để được sợi nhỏ dài. Rửa tủa nhiều lần với cồn tuyệt đối. Để tủa qua đêm, có thể cho vào ngăn mát tủ lạnh để thuận lợi cho q trình tách dung mơi. Kết tủa sau khi qua đêm sẽ kết khối lại và lơ lửng trong hỗn hợp. Dung môi được loại bớt một phần bằng cách chắt bớt ra sau đó được loại hoàn toàn bằng máy ly tâm cao tốc với tốc độ 6000 vòng/phút và được thực hiện trong ít nhất 20 phút. Vừa ly tâm, vừa rửa tủa nhiều lần với cồn 960 cho đến hết màu vàng. Sau đó đem đơng khô để loại hết dung môi thu được polysaccharide khơ, giịn, có màu trắng.
Hình PLA2.5. Chiết carrageenan bằng NaHCO3 (chiết tự nhiên). 10g bột mẫu rong B.gelatinus 200mL dung dịch NaHCO3 0,05M Lọc nóng bằng vải(2-3 lần) Dịch lọc Cơ cạn cịn ½ thể tích
Nguội, đơng như đông sương Tủa cồn tuyệt đối Tỉ lệ mẫu: cồn là 1:5
Để tủa qua đêm
Ly tâm, rửa tủa nhiều lần với cồn 960 đến hết màu Đun trên bếp điện, 900c, 2h
Đông khô
Bếp khuấy từ gia nhiệt
Ly tâm
Sulfate polysaccharide Cặn
Hình PLA2.6. Hình ảnh nấu chiết nóng carrageenan từ rong Đỏ B.gelatinus
tại phịng thí nghiệm Hóa phân tích –Đại học Khánh Hịa Nha Trang. 2.3. Phương pháp xác định thành phần hóa học chính của rong nguyên liệu
2.3.1. Xác định độ ẩm của rong
Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Rửa sạch cốc, để khô, sấy ở nhiệt độ 130oC trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm, cân, tiến hành sấy tiếp ở nhiệt độ 130oC khoảng 1 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm,
cân, sấy tiếp đến khi nào khối lượng cốc giữa hai lần cân không lệch nhau q 5.10-4 thì dừng lại.
Cân chính xác 1,0 g mẫu rong cho vào cốc sấy đã xác định khối lượng không đổi. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 80 oC trong 30 phút. Sau đó nâng nhiệt độ lên 130oC trong 1 giờ. Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân khối lượng rồi tiếp tục cho vào tủ sấy trong thời gian 1 giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân như trên cho tới khi khối lượng không đổi. Kết quả giữa 2 lần cân khơng lệch nhau q 0,5 mg thì dừng lại.
2.3.2. Xác định hàm lượng protein
* Hóa chất
- Dung dịch A:4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2 %) pha trong 1000ml nước cất.
- Dung dịch B:0,5g CuSO4.5H2O (0,5 %) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%) hoặc trong dung dịch NaK Tartrate(Natri- Kali Tactrat) 1%. - Dung dịch C:hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 50:1 (v/v), pha trước khi sử dụng.
Chuẩn độ thuốc thử Folin- Ciocalteu phenol bằng NaOH đến điểm cuối với phenolphtalein. Trên cơ sở chuẩn độ này, thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng.
Tiêu chuẩn có thể chuẩn bị huyết thanh người được pha loãng từ 100 lần đến 1000 lần( khoảng 700 đến 70 µg/ml). Có thể kiểm tra dựa trên tiêu chuẩn của huyết thanh bò.
Dung dịch gốc(làm chất chuẩn):Albumin huyết thanh bò (BSA) 1 mg/ml.
* Các bước tiến hành
- Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10ml nước cất, thu được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/ml.
- Sau đó, pha lỗng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µg/ml để tiến hành xây dựng đường chuẩn.
- Lấy chính xác 0,5 ml dung dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút hoặc lâu hơn.
- Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút hoặc lâu hơn.
- Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng 𝜆 = 750nm. Đối với các dung dịch màu mạnh hơn, các số đọc có thể trong phạm vi khả thi bằng cách đọc gần 500nm.
Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thơng thường.
Kết quả hàm lượng protein được tính tốn từ đường chuẩn BSA đã xây dựng (Bảng 1, hình 1, phụ lục B1).
Sau khi đã xây dựng đường chuẩn:
Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị tương tự như đã nêu trên. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính hàm lượng protein trong các mẫu.
- Hàm lượng nitơ trong các mẫu khô được xác định bằng máy phân tích nguyên tố CHNS /O elemental analyzer (Perkin-Elmer PE2400, Norwalk).
2.3.3. Xác định hàm lượng Lipid
*Tách lipid từ mẫu:
Cân 1 g mẫu đã được xay nhuyễn và trộn đều, cho vào ống thuỷ tinh vial cao thể tích 20 mL. Cho thêm 600 μl nước cất, 5 mL methanol, 10 mL chloroform và 200 μL BHT (Butylated hydroxy toluen). Ngâm mẫu trong dung mơi khoảng 10 phút. Đồng hóa mẫu bằng máy trong 1 phút. Đổ vào ống xilanh có lót tấm giấy lọc GF/C ở dưới đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn. Cho thêm 5mL methanol và 10 mL chloroform vào vial và đồng hóa mẫu trong 20 giây. Đổ dung dịch này vào xilanh, cho mẫu được lọc hết hoàn toàn. Sử dụng pitton xilanh để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu chiết 100 mL. Cho thêm 7,5 mL NaCl 0,9 % vào phễu
chiết chứa dịch mẫu. Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 5oC trong khoảng 4 giờ để dịch mẫu phân chia thành 2 lớp.
* Chiết rút dung dịch lipid
Tách lớp dưới (chứa hàm lượng lipid hịa tan trong dung mơi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 50 ml. Loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hỗn hợp gồm các tạp chất được loại như nước, muối, protein….).
Xác định thể tích chiết ở trên (V). X = V (mL)
Cho thêm 5 mL MeOH 50 % vào mỗi mẫu trong phễu chiết 100 mL. Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần. Cho phân chia tách thành 2 lớp và lắng qua đêm ở 5oC.
* Định lượng lipid
Lớp dưới được rút chảy xuống bình cầu 100 mL. Cô quay chân khơng làm bay hơi dung mơi trong bình cầu ở 37oC đến khi cịn lại thể tích khoảng 1 mL. Hịa tan mẫu lại ngay lập tức bằng một lượng thể tích nhỏ chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc rất nhỏ lượng mẫu đã làm khơ với khơng khí). Chuyển lượng mẫu qua bình định mức 5 mL, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng chloroform vừa đủ 5 mL. Sau khi xử lý xong, dung dịch này được mang đi xác định hàm lượng lipid tổng. Dung dịch này có thể lưu giữ trong tủ đơng –20 oC.
* Xác định hàm lượng lipid tổng
Lấy chính xác 2 mL dung dịch mẫu đã xử lý cho vào một ống thuỷ tinh có nắp 4 mL đã được sấy chân không và cân với lượng khơng đổi, làm khơ bằng khí nitơ. Cho vào tủ sấy chân khơng đến khối lượng không đổi, áp suất khoảng 65-70 psi trong một giờ.
Lipid tổng số (%) tính theo cơng thức: % Xt (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.Vm % Xk (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.T.Vm
Xt: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng tươi của mẫu Xk: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khơ của mẫu m1: Trọng lượng cân ống vial và mẫu sau sấy (g).
m0: Trọng lượng cân ống vial khối lượng không đổi (g). m: Trọng lượng cân mẫu (g).
Vdm: Thể tích định mức sau xử lý (mL)
Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (mL) T: thành phần khô của mẫu, T = (100 - W)/100 W: Độ ẩm của mẫu (%)
2.3.4. Xác định sulfate
Xây dựng đường chuẩn K2SO4 như sau: Cho 20 μL chuẩn K2SO4 ở nồng độ trong khoảng 0,25-1 μg/μL vào ống nghiệm. Thêm vào 3,8 TCA 3%, 1 mL dung dịch gelatin 0,5%, 1 mL dung dịch BaCl2 0,5%. Để yên 15 phút, đo UV-VIS ở bước sóng 360 nm.
Thủy phân 5mg SP trong ống nghiệm có nút vặn bằng 2 mL HCl 1N ở nhiệt độ 100oC, thời gian 6 giờ. Cho 20μL SP đã thủy phân ở nồng độ trong khoảng 1 μg/μL vào ống nghiệm. Thêm vào 3,8 TCA 3%, 1mL dung dịch gelatin 0,5 %, 1mL dung dịch BaCl2 0,5%. Để yên 15 phút, đo UV-VIS ở bước sóng 360 nm. Tính tốn hàm lượng sulfate của carrageenan dựa vào đường chuẩn sulfate đã xây dựng.
Hình PLA2.7. Hình ảnh Xác định sulfate từ rong Đỏ B.gelatinus tại phịng thí
nghiệm Hóa phân tích –Đại học Khánh Hòa Nha Trang.
2.3.5. Xác định Carbohydrate
Xác định hàm lượng Carbohydrate bằng phương pháp Phenol-Sulfuric: Lấy 2 mL dung dịch cần xác định có nồng độ trong khoảng 40-100 µg/mL, thêm 0,1 mL dung dịch cồn phenol, lắc cho đến khi trong suốt. Thêm 10 mL acid sulfuric đậm đặc, lắc rồi để nguội, sau đó đun cách thủy ở nhiệt độ 60oC trong 10 phút, để nguội, đo trên UV ở bước sóng 484,5 nm.
2.3.6. Xác định 3,6-Anhydrogalactose theo phương pháp Yaphe và CS
* Chuẩn bị dung dịch gốc:
cất. Bảo quản trong chai màu, giữ trong tủ lạnh.
b) 1,1-Diethoxyethane (acetal): Lấy 100μL (695μmol) hòa tan trong 10 mL nước cất. Giữ trong chai màu, bảo quản trong tủ lạnh. Lấy 1 mL pha loãng với nước cất thành 25 mL trước khi trộn với thuốc thử.
c) Dung dịch gốc D-fructose chuẩn: cân 27 mg hòa tan trong 50 mL của nước cất đã cho bảo hòa acid benzoic. Bảo quản trong tủ lạnh.
* Chuẩn bị dung dịch làm việc:
a) Thuốc thử resorcinol-acetal: thêm 100 mL HCl đậm đặc vào 9 mL dung dịch gốc resorcinol và thêm 1 mL của dung dịch gốc acetal đã được pha loãng, trộn đều. Chuẩn bị dung dịch này trước khi phân tích.
b) Chuẩn D-fructose: hịa tan 3 mL dung dịch gốc chuẩn fructose thành 100 mL trong nước cất, tương ứng với nồng độ fructose là 16,2 μg/mL.
c) Chuẩn bị mẫu: cân 10 mg carrageenan hòa tan trong 100 mL nước cất nóng, tương ứng với 100 μg/mL.
* Tiến hành phân tích:
Coi fructose như là chất chuẩn, lấy 1 mL dung dịch cần xác
định có nồng độ từ 0 đến 0,25 µmol/mL. Thêm 10 mL thuốc thử resorcinal-acetal ở 20oC, lắc trong 4 phút, sau đó đun ở 80oC trong 10 phút. Làm lạnh ống nghiệm trong chậu đá trong 1,5 phút và đo độ hấp thụ trên máy UV-VIS ở bước sóng 555 nm trong khoảng thời gian là 15 phút. Mẫu đo tránh tiếp xúc với ánh sáng mạnh.
Hàm lượng của 3,6-anhydro-L-galactose được xác định so với chuẩn D-fructose và nhân với giá trị 1,087. Mẫu được phân tích 3 lần để tính giá trị trung bình.
PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
PHỤ LỤC B1: Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry Bảng B1. Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA
(µg/ml)
Nồng độ BSA (µg/mL)
OD750
OD1 OD2 OD3 OD
20 0,094 0,099 0,097 0,097 40 0,164 0,161 0,165 0,163 60 0,225 0,229 0,226 0,227 80 0,264 0,265 0,261 0,263 100 0,325 0,321 0,321 0,322 120 0,383 0,385 0,384 0,384