Nhóm tín hiệu
Mẫu TN1 Mẫu TN2 Mẫu TN3 Mẫu TN4 Dự đoán dạng
A 5,344 -carrageenan (DA). [101, 103] 5,354 B 5,3 5,27 C 5,248 µ–carrageenan [101, 103] (D6S) 5,242 D 5,196; 5,188 5,179 5,17 5,172 κ-carrageenan (DA) [102] 5,187; 5,180 5,172 E 5,12 κ-carrageenan (DA) 5,123 G 5,09 5,096 5,095 5,096 κ-carrageenan (DA) [102] 5,092 5,091 5,095 H 5,07 5,075 5,075 5,075 β-carrageenan (DA) [102] 5,071 5,07 5,071
Dựa trên dữ liệu phổ, chúng tôi xác định sự có mặt của các loại carrageenan khác nhau trên cơ sở vị trí và cường độ các peak trong vùng anomer (5,1 đến 5,7 ppm) của Hydro của các gốc D-galactose và D-galactose- anhydrogalactose (DA) như sau: Tín hiệu 5,07-5,075ppm thuộc về β- carrageenan (DA), tín hiệu 5,09-5,096 ppm thuộc về κ-carrageenan (DA) (hình 3.11-3.14) [102], tín hiệu 5,17-5,196ppm thuộc về κ-carrageenan (DA) (hình 3.11- 3.14), [102], tín hiệu 5,12ppm thuộc về κ-carrageenan (DA), tín hiệu 5,17ppm thuộc về κ-carrageenan (DA), peak tại 5,25ppm thuộc về µ– carrageenan (D6S), tín hiệu 5,35ppm thuộc về -carrageenan (DA) và tín hiệu 5,25 ppm xác nhận sự có mặt của gốc D-galactose-6-sulfate (G6S) thuộc về - carrageenan [101, 103].
Kết quả thành phần hóa học và phổ hồng ngoại của tất cả các mẫu đều xác nhận sự có mặt 02 dạng carrageenan là κ-carrageenan và β-carrageenan, phân tích phổ 1H NMR của các mẫu trong vùng anomeric (bảng 3.11) và các hình(3.11b-3.14b) đều xuất hiện các tín hiệu của H-anomeric của các gốc galactose (D) và 3,6 - anhydrogalactose (DA) trong phân tử cơ bản của κ- carrageenan và β-carrageenan. Như vậy tất cả các mẫu chiết tự nhiên và chiết xử lý kiềm tại các điều kiện chiết khác nhau đều là hỗn hợp của 02 dạng carrageenan.
Trong vùng anomeric của mẫu chiết lạnh tự nhiên ngồi các cụm tín hiệu xác nhận sự có mặt của κ-carrageenan và β-carrageenan còn xuất hiện các tín hiệu H-anomeric tại vùng 3,5ppm của gốc đường 3,6- anhydrogalactose (AG trong phân tử -carrageenan) và cụm tín hiệu tại vùng 5,25ppm của D-galactose-6-sulfate thuộc về µ–carrageenan.
Xử lý kiềm là thực hiện phản ứng đóng vịng nhằm biến đổi từ monomer D-galactose-6-sulfate sang D-galactose, điều này giải thích sự khơng xuất hiện các tín hiệu thuộc về µ–carrageenan trong các mẫu TN2 và TN4 là các mẫu xử lý kiềm.
Từ kết quả giải phổ 1H NMR, cho thấy polysaccharide chiết từ loài rong Betaphycus gelatinus chủ yếu chứa 02 loại carrageenan là κ-carrageenan và β-carrageenan. Để xác nhận kết quả này về 2 loại carrageenan trên, chúng
tôi tiến hành phân tích phổ 13C NMR và phổ 2 chiều các mẫu phân đoạn polysaccharide có chứa hàm lượng lớn trong mẫu chiết lạnh và chiết nóng. *Phổ 13C NMR của các mẫu polysaccharide
Hình 3.15. Phổ 13C NMR của mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng). Phổ đầy đủ phía trên và phổ vùng anomeric phía dưới.
Hình 3.16. Phổ 13C NMR của mẫu TN4 (chiết kiềm nóng). Phổ đầy đủ phía trên và phổ vùng anomeric phía dưới.
Phổ 13C NMR của 02 mẫu TN2 và TN4 tương tự như phổ 13C NMR trước đây đối với phổ của carrageenan [104] bao gồm các nhóm tín hiệu sau: vùng tín hiệu C-anomeric, vùng C-pyrannose và vùng G-C6 và DA-C6. Tại vùng C-anomeric, những tín hiệu này thuộc về nguyên tử C1 của gốc DG (D- galactose) và C1 của gốc DA (3,6 – anhydro-D-galactose). Đây là những vị trí mà nguyên tử C liên kết với nhiều nguyên tử O nhất. Tín hiệu ứng với vùng trường thấp hơn được gán cho tín hiệu cộng hưởng của nguyên tử G-C1 do nguyên tử này chịu ảnh hưởng của vịng pyrannose với 02 nhóm OH và đặc biệt là của nhóm SO3- nên có mật độ điện tích cao nhất. Tín hiệu cịn lại được gán cho nguyên tử C1-DA, nguyên tử C-anomer của liên kết 1-4. Cụm tín hiệu tại vùng trường cao thuộc về các nguyên tử G-C6 và DA-C6 do các nguyên tử này cùng ít chịu ảnh hưởng của các liên kết với O nhất và liên kết trực tiếp với 2 proton. Trong đó G-C6 có độ dịch chuyển hóa học tại vùng trường cao nhất tương ứng với độ dịch chuyển hóa học là 63,5 và 63,6 ppm và nhóm tín hiệu tại 67-68 ppm thuộc về DA-C6.
Theo kết quả phân tích phổ 1H NMR thì các mẫu TN2 và TN4 là hỗn hợp của 02 loại carrageenan chính là κ-carrageenan và β-carrageenan. Tuy nhiên trên phổ 13C NMR của chúng ngoài tồn tại 03 vùng tín hiệu thuộc về carrageenan cịn xuất hiện 02 tín hiệu khác nhau. Đó là peak tại 179,02 ppm với mẫu (TN2), peak 179,06 ppm với mẫu (TN4) xác nhận sự có mặt nguyên tử C của nhóm carboxyl và peak trong vùng 22,5 ppm được gán cho nhóm methyl. Sự có mặt 02 tín hiệu này chứng tỏ trong phân tử carrageenan có nhóm pyruvate và điều này có nghĩa là một phần monomer D-galactose rong disaccharide được thay thế bởi monomer 4’,6’-O-(1-carboxyethylidine)-β-D- galactopyrannose (GP). Như vậy trong mẫu TN2 và TN4 đều có chứa 03 dạng carrageenan như sau : κ-carrageenan, β-carrageenan và β -carrageenan có chứa acid pyruvic.
Từ những kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ ở trên, chúng tơi có thể kết luận rằng, polysaccharide được 03 loại carrageenan được cấu thành bởi 03 disaccharide tạo thành chuỗi sau [→3-β-D-Galactose-4-sulfate-(1→4)-α-L- 3,6-anhydrogalactose(1→],→3-β-D-Galactose-(1→4)-
α-L-3,6-anhydrogalactose(1→] và [→3-β-4’,6’-O-(1-carboxyethylidine)-β-D- galactose-(1→4)-α-L-3,6-anhydrogalactose(1→]. Kết quả gán phổ cộng hưởng từ được đưa ra ở bảng 3.12.