Chẩn đốn bệnh là một khâu quan trọng để phát hiện sớm bệnh DTL. Việc chẩn đốn khơng phải dễ dàng, lúc nào chúng ta cũng thực hiện được nhanh chĩng và chính xác. Bởi các biểu hiện về triệu chứng lâm sàng, về bệnh tích đại thể và vi thể đối với bệnh DTL thường cĩ sự biến đổi rất đa dạng. Do sự khác nhau về độc lực của các chủng virus, về số lượng virus
xâm nhập vào các cơ quan và về sự mẫn cảm của cơ thể bệnh súc.
Cũng chính những khĩ khăn này địi hỏi chúng ta cần cĩ những phương pháp chẩn đốn mang tính tổng quát và hiệu quả về các mặt.
Các phương pháp chẩn đốn thường dựa vào: chẩn đốn dịch tễ, chẩn đốn qua triệu chứng lâm sàng, mổ khám bệnh tích, chẩn đốn virus học,...
1.3.1. Chẩn đốn virus học
1.3.1.1. Tiêm động vật thí nghiệm
Lấy bệnh phẩm (máu, lách, hạch lâm ba,…) xử lý bằng kháng sinh phổ rộng pha thành huyễn dịch tiêm cho lợn khỏe mạnh 3 - 4 tháng tuổi, khơng nằm trong ổ dịch DTL, tiêm dưới da 1 ml máu độc nghi cĩ chứa virus DTL hoặc 1 gam lách. Ở những lợn tiêm sẽ xuất hiện triệu chứng và bệnh tích DTL giống như trong thiên nhiên.
Phương pháp này được áp dụng trong trường hợp triệu chứng và bệnh tích trên lâm sàng và giải phẫu bệnh học khơng đủ để kết luận và cần chính xác ổ dịch để cơng bố dịch. Phương pháp này cho kết quả chính xác nhưng nĩ tốn kém và mất nhiều thời gian. Bên cạnh đĩ nếu virus cĩ độc lực yếu, chỉ gây bệnh cho lợn con thử nghiệm những triệu chứng nhẹ, làm cho con vật được miễn dịch, sẽ khơng chẩn đốn được bệnh [17].
1.3.1.2. Phương pháp tăng cường độc lực của virus Newcastle
Phương pháp này được Kumagai và CS phát kiến (Kumagai và CS, 1958) và chẩn đốn hĩa (Kumagai và CS, 1961) dùng để chẩn đốn virus DTL, cịn gọi tắt là phương pháp END, sau đĩ đã được lặp lại và đánh giá cao bởi Loan (1965).
Dùng mơi trường tế bào dịch hồn lợn (lứa cấy tế bào đơn lớp) cấy virus DTL, sau 5 ngày cấy virus Newcastle thấy virus Newcastle nhân lên mạnh và gây bệnh tích tế bào.
Nếu mơi trường tế bào dịch hồn lợn chỉ cấy virus Newcastle thì virus sẽ khơng gây được bệnh tích tế bào. Điều này chứng tỏ virus DTL đã làm tăng độc lực virus Newcastle [18].
1.3.1.3 Thí nghiệm trung hịa trên thỏ
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc virus DTL cường độc và virus DTL nhược độc cĩ tính gây bệnh khác nhau cho thỏ và lợn, nhưng cĩ tính kháng nguyên giống nhau. Cĩ thể dùng virus DTL cường độc tiêm cho thỏ gây miễn dịch. Sau đĩ chứng minh tính miễn dịch của thỏ đối với virus DTL bằng cách tiêm virus nhược độc DTL. Phương pháp này cĩ độ chính xác cao nhưng tốn thời gian và kinh phí [18].
1.3.2. Chẩn đốn huyết thanh học
Bên cạnh phương pháp phân tích vật chất di truyền đã được áp dụng như PCR (Eisentein, 1990; Saiki và CS, 1988). RT-PCR hiện tại các phương pháp huyết thanh học được coi là thích hợp nhất cho mục đích chẩn đốn bệnh DTL cũng như một số bệnh do virus khác [08].
1.3.2.1. Phản ứng miễn dịch đánh dấu (ELISA)
Đây là phương pháp được áp dụng ngày càng rộng rãi trong chẩn đốn bệnh DTL (Nguyễn Tiến Dũng và CS, 2002; Nguyễn Thị Phương Duyên và CS, 2000). Kỹ thuật miễn dịch enzyme cĩ độ đặc hiệu rất cao do sử dụng kháng thể đơn dịng kháng virus DTL nên khắc phục được hiện tượng dương tính giả do virus gây bệnh tiêu chảy ở bị, như sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp đặc hiệu virus như glycoprotein Ems hay E2 (Langgedik và CS, 2001; Floegel - Niesmann, 2001) hoặc phương pháp ELISA cạnh tranh nhưng cĩ độ nhạy giảm so với ELISA thơng dụng (Clavijo và CS, 2001).
Kháng thể đơn dịng cho phản ứng với hai loại glycoprotein vỏ (gp48 và gp53) thì cĩ thể trung hịa virus gây bệnh. Lợn nhiễm bệnh cĩ thể tạo kháng thể với glycoprotein cấu trúc của virus, những protein này tương tự “kháng nguyên hịa tan”. Đáp ứng kháng thể với polypeptid khác, kể cả p14 của nucleocapsid thì rất yếu hoặc khơng cĩ [30].
Những lợn được chủng ngừa vacxin E2 hoặc Ems cĩ thể kháng với virus DTL khi cơng cường độc. Hai loại vacxin chứa baculovirus để tạo E2 hoặc Ems (hoạt động như kháng nguyên).
phát hiện chỉ khi dùng kháng nguyên Ems tái tổ hợp.
Kỹ thuật ELISA được thiết kế để khơng phát hiện kháng thể ở lợn được chủng ngừa vacxin Ems mà chỉ dùng để phát hiện kháng thể của những lợn nhiễm virus DTL tự nhiên hoặc lợn đã chủng vacxin thơng dụng [31].
Hiện nay đối với bệnh DTL, kỹ thuật này được dùng để phát hiện sự cĩ mặt của HVC.Ag (P125) hoặc hàm lượng kháng thể trong máu,…
1.3.2.2. Phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch
Phản ứng này được Mansi dùng lần đầu tiên (1957) để chẩn đốn virus DTL (Mancini, 1957; theo Nguyễn Như Thanh và CS, 2001) và cải tiến thêm sau đĩ (Mancini, 1965) [18].
1.3.2.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp
Bình thường virus DTL khơng hấp thụ lên hồng cầu nhưng cĩ thể kết bám (hĩa học) nếu hồng cầu đã được xử lý axit tanic. Chất này cĩ một chức gắn với hồng cầu, cịn một chức gắn với protein virus DTL mặc dù khơng gây ngưng kết hồng cầu. Khi gặp kháng thể tương ứng, virus DTL sẽ kết hợp với kháng thể làm hồng cầu dính lại qua cầu nối kháng thể gây hiện tượng ngưng kết hồng cầu [18].
1.3.2.4. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp
Phương pháp này là sự kết hợp giữa các phương pháp ngăn trở ngưng kết và phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp và được mơ tả gần đây.
Phương pháp này dùng để phát hiện kháng nguyên trong các tổ chức nhu mơ bệnh phẩm.
Nguyên lý của phương pháp này là khi nghiền tổ chức nhu mơ với kháng huyết thanh trong điều kiện hĩa băng nên cĩ thể làm vỡ tế bào nhờ các tinh thể nước đá hình thành trong và ngồi tế bào chất. Nếu trong tổ chức nhu mơ đĩ cĩ kháng nguyên, thì kháng nguyên đĩ sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng thể trong kháng huyết thanh, làm cho hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh giảm. Sau khi quay ly tâm để loại bỏ tổ hợp kháng nguyên - kháng thể cùng với tổ chức nhu mơ, sự sụt giảm hiệu giá trong kháng huyết thanh được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp [25]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.3.2.5. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang
Phương pháp này trong chẩn đốn bệnh DTL, dùng kháng thể DTL đã được nhuộm huỳnh quang, cho tiếp xúc với kháng nguyên là bệnh phẩm nghi chứa virus DTL (lách, hạch, phủ tạng,…) đã được cố định trên phiến kính (kỹ thuật huỳnh quang lát cắt - FATST: (Stair và CS, 1963) hoặc là lứa cấy tế bào đơn lớp (kỹ thuật kháng thể huỳnh quang lứa cấy tế bào - FACCT: (Mengeling và CS, 1963) [18].
Nếu cĩ kháng nguyên và kháng thể tương ứng, tức là cĩ virus DTL trong bệnh phẩm thì cĩ thể kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể huỳnh quang và tổ hợp này được lưu lại trên phiến kính ngay cả sau khi phiến kính được rửa.
Kháng nguyên được nhuộm màu huỳnh quang sẽ phát sáng rõ rệt dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phương pháp FATST cĩ ưu điểm là chẩn đốn nhanh, cĩ thể hồn thành trong hai giờ. Tuy vậy, trong nhiều trường hợp khĩ phân biệt giữa sự phát màu đặc hiệu và khơng đặc hiệu (Cottral, 1978).
Phương pháp FACCT được sử dụng để phát hiện kháng nguyên virus DTL trong lứa cấy tế bào thận lợn (PK - 15) nuơi trên lá kính đã bị gây nhiễm bởi huyễn dịch tổ chức lợn bệnh.
Ưu điểm của phương pháp này là cĩ tính đặc hiệu cao và dễ giải thích kết quả nhưng nhược điểm là mất khá nhiều thời gian, ít nhất phải 16 giờ, bên cạnh những yêu cầu của việc nuơi cấy tế bào tổ chức (Stewart, 1981).
Đối với nước ta phương pháp này tốn kém do giá thành kháng thể đánh dấu (conjugate) cịn cao và ta chưa chủ động được nguồn cung cấp.
Tổ chức thích hợp là lách, hạch hạnh nhân và các hạch lympho khác (tốt nhất là hạch dưới hàm) đối với việc phân lập virus và phát hiện kháng nguyên virus bởi kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.
Tốt nhất là lấy mẫu từ lợn cĩ tổng số bạch cầu trong 1mm3 thấp hơn 10.000. Trong trường hợp bệnh DTL mãn tính, tổ chức cĩ thể lấy mẫu là thai
sảy và thai chết yểu. Mẫu huyết thanh do phản ứng trung hịa virus cĩ thể lấy từ lợn khỏi bệnh, lợn nái sẩy thai, đẻ thai chết hoặc cĩ ổ đẻ ít con.
Bên cạnh đĩ, cĩ thể sử dụng các kháng thể đánh dấu huỳnh quang (fluorescence) và peroxidaza phát hiện kháng nguyên từ lát cắt lạnh hoặc sau ba lần cấy truyền trên lứa cấy tế bào một lớp [38].
1.3.3. Kỹ thuật PCR: polymerase chain reaction
ARN virus cĩ tính đặc hiệu cao đặc trưng cho lồi và cĩ thể dùng làm khuơn tổng hợp invitro phân tử ADN tương bù một sợi nhờ enzyme sao chép ngược (RT: reverse transcriptase). Sau đĩ ADN một sợi được tách khỏi ARN khuơn và lại làm khuơn để tổng hợp sợi ADN tương bù với nĩ nhờ enzyme ADN - polymeraza. Nhờ phản ứng chuỗi polymeraza (PCR: polymerase chain reaction) đoạn ADN cĩ kích thước đặc hiệu phù hợp với cặp mồi oligonucleotid được tổng hợp.
Tổ hợp hai phản ứng trên gọi là RT - PCR. Kỹ thật này dựa trên phiên mã ngược với phản ứng PCR (RT - PCR) và xác định trình tự chuỗi của DNA bằng cDNA từ vùng khơng mã hĩa 5’. Người ta cĩ thể dùng kỹ thuật RT - PCR để phân biệt trình tự chuỗi E2 hoặc cĩ thể dựa vào RT -PCR và rồi dùng enzym hạn chế trên vùng khơng mã hĩa 5’(Straw B.E, và ctv, 1999) [32].
1.3.4. Chẩn đốn bằng phản ứng hĩa học màu
Chất chiết bệnh phẩm nghi DTL bằng cồn đem sấy khơ. Khi gặp axit nitric đậm đặc thì biến đổi thành màu hồng tím nếu cĩ virus DTL. Nếu khơng cĩ virus DTL thì cĩ màu vàng [22].