PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn héo xanh
Các mẫu có triệu chứng bệnh HXVK sau khi thu, cắt đoạn gốc thân nhiễm bệnh thấy có mơ dẫn có màu thâm đen, khi nhúng vào cốc nước sạch thì có dịng dịch vi khuẩn màu trắng sữa chảy ra. Một số triệu chứng khác có thể giúp nhận dạng nhanh như cây chuyển héo nhanh, toàn thân hay bị một phần, hoặc nếu cây bị nhiễm bệnh HXVK ở giai đoạn muộn có triệu chứng ra rễ phụ và ở gần gốc có những nốt sưng, ta tiến hành thu đoạn gốc có chiều dài khoảng 3 đến 5 cm, cho vào túi sạch, ghi nhẵn với các thông tin về nơi thu mẫu, ngày tháng, giống, cây trồng vụ trước, v.vv..
Mẫu bệnh được rửa sạch sau đó khử trùng bằng cồn ethanol 70%. Cắt mẩu nhỏ mẫu bệnh kiểm tra dịch vi khuẩn chẩy ra tại vết cắt. Và cắt lấy những phần thân màu đen nhạt đem ngâm trong ống chứa nước cất vô trùng. Sau một khoảng thời gian nhất định ta sẽ thấy trên mạch dẫn của đầu cắt tiết ra giọt dịch và dòng dịch vi khuẩn màu trắng sữa chảy ra. Sau khoảng 20 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ đoạn mẫu ra khỏi ống. Các ống dịch vi khuẩn này được bảo quản ở 270C để sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Phương pháp phân lập truyền thống được dùng dựa trên việc sử dụng mơi trương TZC để nhận dạng các dịng vi khuẩn thơng qua hình dạng và màu sắc khuẩn lạc khi phát hiện trên môi trường này. Chi tiết của phương pháp này được miêu tả trong các cơng trình của Kelman et al. (1954) [17].Pha loãng dịch vi khuẩn trong ống với dung dịch đệm hịa lỗng đểđạt nồng độ thích hợp sao cho có thể thu được các khuẩn lạc riêng biệt sau khi cấy gạt trên môi trương TZC. Để hộp lồng trong ủ định ôn, ở nhiệt độ 270C theo dõi kết quả sau 24, 48, 72 giờ. Từ mỗi nhóm hình thái khuẩn lạc được quan sát dưới kính hiển vi và tiến hành chọn 3 - 5 khuẩn lạc để cấy chuyển sang đĩa petri mới để nhân lên vạch trên môi trường. Sau 24 - 48 giờ giữ ở nhiệt độ 270C, tiến hành chọn những những khuẩn lạc màu sữa trắng, tâm phớt hồng có kiểu hình thái, màu sắc điển hình của lồi vi khuẩn gây bệnh HXVK có độc tính để giữ trong nước vô trùng hoặc trong nước cất (nếu cần bảo quản lâu hơn) để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.4.Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Các mẫu giống cà chua cần nghiên cứu được sử lý hạt bằng dung dịch NaOCl (Sodium hypochlorite) 1% trong 15 phút sau đó làm sạch bằng cách để dưới vòi nước chẩy liên tục trong 30 phút rồi hong khô trước khi gieo. Sử dụng khay nhựa (50 lỗ) và giá thể sạch để gieo hạt. Khay đã gieo hạt được để trên giá, che mưa, nắng và luôn đảm bảo đủ ẩm, nhiệt độ 250C-320C.
Sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp sát thương rễ. Sử dụng nguồn vi khuẩn được phân lập từ cây bệnh điển hình (hình 4), tạo khuẩn lạc đặc trưng để lây nhiễm (hình 5). Cây con 3 tuần tuổi (4-5 lá thật) được sát thương rễ bằng cách nhổ lên trồng sang khay mới (đã xử lý mầm bệnh), Trồng xong, mỗi cây được tưới 10ml dung dịch vi khuẩn có nồng độ 108cfu/ml (OD=0,3). Cây đã lây nhiễm bệnh luôn được đảm bảo đất đủ ẩm, nhiệt độ 270C – 320C.
Số cây héo do bệnh HXVK được theo dõi 7 ngày một lần và cần theo dõi trong 4 tuần. Thống kê tổng số cây bị chết héo do vi khuẩn Ralstonia
solanacearum trên tổng số cây thí nghiệm. Tính tỷ lệ bệnh (%) theo cơng thức
trên.
Hình 4: Mẫu cây bị bệnh Hình 5: Khuẩn lạc R. solanacearum trên môi trường TZC