Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Quá trình nghiên cứu được thực hiện trong 4 năm từ 01/2014 đến 12/2017. Thực nghiệm nghiên cứu được tiến hành tại:
- Trung tâm Giám định Sinh học - Viện Khoa học hình sự - Bộ Cơng an. - Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Các bước chính thực hiện nghiên cứu
Những bước chính trong q trình nghiên cứu được thực hiện như sau:
Hình 2.1. Sơ đồ các bước chính xây dựng tần suất alen phục vụ giám định ADN
Thu mẫu máu trên FTA card (trên 150 mẫu) Thường >150 cho mỗi nhóm
Kiểm định giả thuyết theo Hác đi - Van béc
cho các alen của các locus phân ly độc lập
Quyết định số lượng mẫu của các tộc người
Thu mẫu
Xác định tần suất alen cho mỗi locus
Sử dụng cơ sở dữ liệu để xác định tần suất hồ sơ ADN phân tích được Tộc người 1 Tộc người 2.. Tộc người 9
Phân tích ADN
Tập hợp các hồ sơ
2.4.2. Phương pháp thu mẫu máu
2.4.2.1. Tiêu chí tiến hành thu mẫu
Mẫu máu của các cá thể thuộc các tộc người khác nhau trong cộng đồng các tộc người Việt Nam được thu thập ngẫu nhiên khơng có quan hệ huyết thống gần gũi. Việc thu thập mẫu được căn cứ theo hồ sơ nhân thân được cung cấp bởi Công an các quận, huyện trực thuộc các tỉnh, thành phố trên địa bàn tồn quốc có các tộc người tiến hành nghiên cứu.
Dựa vào danh sách cá nhân được Công an các quận, huyện trực thuộc các tỉnh, thành phố cung cấp, các mẫu được tiến hành, thu thập:
- Thu mẫu ngẫu nhiên ở nhiều địa phương khác nhau.
- Kiểm tra lý lịch trích ngang (chứng minh thư nhân dân, giấy khai sinh, hồ sơ nghiệp vụ Công an Nhân dân...). Hỏi trực tiếp người được thu mẫu để bổ sung thông tin (nếu cần). Ghi chép đầy đủ thông tin bao gồm ngày tháng năm sinh, quê quán, họ tên cha, mẹ, nguồn gốc, quê quán, địa chỉ thường trú, tạm trú vào danh bản ADN cá nhân.
Mẫu đạt tiêu chuẩn là mẫu có đầy đủ thông tin về nhân thân, thông tin về bố và mẹ, đồng thời xác định bố và mẹ đều cùng một tộc người cần thu thập.
Có bổ sung các mẫu đã được phân tích trong q trình giám định ADN, các mẫu trong quá trình giám định xác định huyết thống cha con được thu theo phương pháp thu mẫu giám định theo quy định của Ngành Công an.
Việc thu mẫu được tiến hành như sau:
- Dùng kim chích đầu ngón tay và thấm trực tiếp vào giấy FTA®
(Hình 2.2) - Để khơ tự nhiên, đóng gói và bảo quản theo quy định.
2.4.2.2. Tiêu chí loại trừ khi thu mẫu
Có một số tiêu chí để loại trừ những mẫu không đủ điều kiện tiến hành nghiên cứu như sau:
- Sàng lọc bỏ các mẫu có quan hệ huyết thống với nhau thông qua thông tin cá nhân.
- Người Kinh được coi là người Kinh của các khu vực miền Bắc, Miền Trung và miền Nam khi cả bố mẹ, quê quán, hộ khẩu thường trú đều thuộc các khu vực miền Bắc, Miền Trung hoặc miền Nam để đảm bảo độ chính xác về nguồn gốc khu vực.
2.4.3. Cơ sở chọn lựa các tộc người trong nghiên cứu
Xuất phát từ tình hình thực tế trong đấu tranh phịng chống tội phạm và dựa vào số dân của các tộc người, đã tiến hành nghiên cứu và lựa chọn 8 tộc người thiểu số sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam, bao gồm các tộc người có số dân khoảng 1 triệu người trở lên (Tày, Thái, Mường, Khmer, H‟mông, Nùng, Hoa, Dao) và tộc người chiếm đại đa số dân cư là tộc người Kinh [13].
2.4.4. Địa điểm thu mẫu máu của các tộc người
2.4.4.1. Các địa điểm thu mẫu của người Kinh
Các mẫu được thu tại địa bàn các tỉnh và phân theo 7 khu vực địa lý hành chính theo quy định của Chính phủ ở ba miền Bắc, miền Trung - Tây Nguyên và miền Nam.
Miền Bắc: Khu vực Đông Bắc Bộ gồm 9 tỉnh: Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Phú Thọ, Bắc Giang, Quảng Ninh.
Khu vực Tây Bắc gồm 6 tỉnh: Lào Cai, Lai Châu, Điện Biên, Sơn La, Hịa Bình, Yên Bái.
Khu vực đồng bằng châu thổ sơng Hồng: có 10 tỉnh bao gồm Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Hải Dương, Hải Phòng, Hưng Yên, Thái Bình, Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình.
Miền Trung: Khu vực Bắc Trung bộ: bao gồm 6 tỉnh Thanh Hoá, Nghệ An,
Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên - Huế.
Miền Trung - Tây Nguyên: bao gồm 13 tỉnh, thành phố: Đà Nẵng, Quảng
Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng.
Miền Đông Nam Bộ: bao gồm 6 tỉnh, thành phố: thành phố Hồ Chí Minh,
Tây Ninh, Bình Dương, Bình Phước, Đồng Nai và Bà Rịa - Vũng Tàu
Miền Tây Nam Bộ: bao gồm 13 tỉnh, thành phố: Tây Ninh, Long An, Đồng
Tháp, Tiền Giang, An Giang, Bến Tre, Vĩnh Long, Trà Vinh, Hậu Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau.
Tộc người Kinh có số lượng mẫu được thu nhiều nhất là 9.620 mẫu và được thu tại 63 tỉnh thành phố trong cả nước. Mẫu được thu tại các tỉnh, thành phố có số lượng khác nhau, tập trung chủ yếu tại 2 khu vực là khu vực đông Bắc Bộ (3.032 mẫu) và khu vực đồng bằng châu thổ sông Hồng (5.191 mẫu).
2.4.4.2. Các địa điểm thu mẫu của người Tày
Mẫu người của tộc người Tày được tiến hành thu tại địa bàn các huyện thuộc các tỉnh: Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Yên Bái, Tuyên Quang, Hà Giang, Lào Cai, Điện Biên, Quảng Ninh, Phú Thọ, Bắc Giang, Hà Nội và Hịa Bình.
Số mẫu thu được của người Tày là 936 mẫu, tập trung tại 2 vùng Đông Bắc Bộ và Tây Bắc Bộ, ngồi ra khơng tiến hành thu mẫu người Tày tại các địa bàn khác.
2.4.4.3. Các địa điểm thu mẫu của người Thái
Mẫu của các cá nhân thuộc tộc người Thái được thu tại địa bàn các huyện thuộc các tỉnh: Sơn La, Điện Biên, Hịa Bình, Thái Ngun, Thanh Hóa và Nghệ An. Số lượng mẫu thu được của tộc người Thái đạt 775 mẫu.
2.4.4.4. Các địa điểm thu mẫu của người Mường
Các mẫu của người Mường được thu thập tại địa bàn các huyện thuộc các tỉnh: Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang, Phú Thọ, Hà Nội, Vĩnh Phúc, Hịa Bình, Ninh Bình và Thanh Hóa. Mẫu của tộc người Mường thu được là 155 mẫu.
2.4.4.5. Các địa điểm thu mẫu của người Khmer
Các mẫu người Khmer được thu tại địa bàn các huyện thuộc các tỉnh: Trà Vinh, Cần Thơ, Sóc Trăng, Hậu Giang, Bạc Liêu, Thành phố Hồ Chí Minh, Kiên Giang và Tây Ninh.
Người Khmer hầu hết chỉ sinh sống tại một số tỉnh, thành phía Nam. Các tỉnh có số người Khmer đơng nhất là Sóc Trăng, Trà Vinh và Kiên Giang. Cũng như người Hoa, số lượng mẫu thu của người Khmer chỉ đạt được mức tối thiểu là 150 mẫu.
2.4.4.6. Các địa điểm thu mẫu của người H’mông
Mẫu thuộc tộc người H‟mông được thu tại địa bàn các huyện thuộc các tỉnh: Lai Châu, Yên Bái, Cao Bằng, Lào Cai, Điện Biên, Sơn La, Tuyên Quang và Hịa Bình. Tộc người H‟mơng được thu tập trung chủ yếu ở các tỉnh thuộc Đông và Tây bắc Việt Nam như: Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Sơn La, đạt 967 mẫu.
2.4.4.7. Các địa điểm thu mẫu của người Nùng
Đối với người Nùng, các mẫu được thu tại địa bàn các huyện thuộc các tỉnh: Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Lào Cai, Hà Giang, Tuyên Quang, Điện Biên và Thái Nguyên, số lượng mẫu thu được là 405 mẫu.
2.4.4.8. Các địa điểm thu mẫu của người thuộc tộc người Hoa
Mẫu của tộc người Hoa sinh sống tại Việt Nam được thu tại địa bàn các huyện thuộc các tỉnh: Vĩnh Phúc, Hải Dương, Quảng Ninh, Thành phố Hồ Chí Minh và Kiên Giang, số lượng mẫu thu được là 150 mẫu.
2.4.4.9. Các địa điểm thu mẫu của người thuộc tộc người Dao
Đối với tộc người Dao, mẫu được thu tại địa bàn các tỉnh: Tuyên Quang, Hà Giang, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Sơn La, Lai Châu, Yên Bái, Lào Cai, Kon Tum, Hịa Bình, Quảng Ninh và Thái Nguyên. Số lượng mẫu thu được là 238 mẫu.
2.4.5. Phương pháp tách chiết ADN
Tách chiết ADN từ mẫu giấy FTA card được thực hiện trên máy Robot Tecan với kít tách chiết PrepFiler™ (PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit - Mỹ) (Hình 2.3).
PrepFiler™ là bộ kit chuyên dụng, dùng để tách chiết ADN sử dụng robot tách chiết ADN.
Bộ kít này có thể tách được ADN từ các mẫu có hàm lượng ADN thấp như mẫu tóc, mẫu nước bọt, mẫu bã kẹo cao su, mẫu móng chân tay...[20, 23, 86].
Quy trình tách chiết ADN bằng kít PrepFiler™ được sơ đồ theo các bước cơ bản trong (Hình 2.3)
Hình 2.3. Quy trình tách chiết ADN bằng kít PrepFiler [19, 23]
2.4.6. Phương pháp định lượng ADN
Trong nghiên cứu này, ADN được định lượng bằng bộ kít Quantifiler™ (Quantifiler™ Human DNA Quantification Kit - Mỹ). Phản ứng được thực hiện trên máy Illumina Eco Real - Time PCR (Mỹ).
Bộ kít Quantifiler™ được thiết kế để định lượng ADN của người, bộ kít cho phép nhân bản ADN có trong mẫu bằng máy Real time PCR và đã được chuẩn hóa cho giám định ADN.
Bộ kít có thể định lượng mẫu ADN được tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm mẫu máu, tinh dịch, mô và các nguồn ADN từ cơ thể người khác, bộ kít cho phép định lượng ADN với một biên độ rộng từ 0,023 ng/µl đến > 50 ng/µl.
2.4.7. Phương pháp PCR
Sau khi thu được các mẫu ADN đạt tiêu chuẩn, bước tiếp theo, tiến hành phản ứng PCR khuếch đại các mẫu bằng bộ kit Identifiler® (AmpFlSTR® Identifiler® Plus). Đây là bộ kít đặc hiệu nhân cùng lúc 15 locus STR và 1 locus giới tính, thành phần của mỗi một phản ứng thực hiện theo quy định của nhà sản xuất
2.4.8. Phương pháp điện di mao quản
Chuẩn bị mẫu trước khi điện di: Ngoài các mẫu nghiên cứu, bước tiếp theo chuẩn bị thêm hỗn hợp phản ứng cho thang alen chuẩn. Thành phần và tỷ lệ thể tích từng hỗn hợp phản ứng được thực hiện như hướng dẫn của nhà sản xuất [18, 74].
2.5. Phƣơng pháp tính tần suất alen, kiểm định giả thuyết thống kê và
các chỉ số trong khoa học hình sự
2.5.1. Xác định và tính tần suất alen của tập hợp mẫu
Xác định alen
Sau quá trình điện di huỳnh quang ta thu được các phổ điện di khác nhau. Để xác định chính xác hồ sơ ADN của mỗi locus tiến hành so sánh phổ thu được với băng chuẩn của thang alen. Thang alen chuẩn này chứa toàn bộ các alen chuẩn của từng locus và biên độ các alen (Hình 2.4).
Cá thể dị hợp tử là cá thể có 2 đỉnh khác nhau, cá thể đồng hợp tử là cá thể chỉ có 1 đỉnh duy nhất.
Tính tần suất alen của tập hợp mẫu
Từ kiểu gen xác định được, có thể tính số alen xuất hiện trong từng tộc người cho từng locus khảo sát. Tần suất mỗi alen được tính theo cơng thức sau:
Pi =∑
Trong đó:
Pi: Tần suất của alen i
i: alen i quan sát thấy n: cá thể thứ n
2.5.2. Phương pháp kiểm định giả thiết χ2
Theo định luật Hardy–Weinberg, ở trạng thái cân bằng quần thể ngẫu phối có 2 alen, giả thiết tần suất các alen tương ứng là p và q thì:
(p + q)2 = 1 hay: p2 + 2pq + q2 = 1
Với quần thể có đa alen: (p + q + r +…)2
= 1 hay:
p2 + 2pq + q2 + 2qr + r2 + … = 1 [32, 66] Cơng thức để tính giá trị χ2 như sau:
χ2
= ∑
Trong đó O: tần suất alen quan sát được từ thực nghiệm. E: tần suất quan sát được, tính theo lý thuyết. k: số alen xác định được.
Giá trị χ2 được xác định tại bảng phân bố χ2 với các bậc tự do tương ứng với các mức xác suất tương ứng. Trong các thí nghiệm sinh học, 3 mức xác suất thường được sử dụng là P = 0,05; P = 0,01 hoặc P = 0,001.
Nghiên cứu đã lựa chọn giá trị P = 0,05 [27, 29, 31, 32].
2.5.3. Phương pháp tính các chỉ số sử dụng trong khoa học hình sự
- Tần suất alen được tính từ mỗi hồ sơ ADN thu được trong tập hợp dữ liệu. Việc tính tốn tần suất và các chỉ số HWE (Định luật Hardy–Weinberg), H(obs) (Dị hợp tử quan sát), H(exp) (Dị hợp tử mong đợi), chỉ số PD (khả năng phân biệt), PE (khả năng loại trừ) và TPI (chỉ số huyết thống cha con điển hình) được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel. Các chỉ số này đánh giá tính đa hình các alen của quần thể đó đồng thời xác định tần suất thu thập được đã có đủ độ tin cậy để sử dụng vào việc xác định cá thể hoặc xác định huyết thống cha, mẹ - con hay chưa.
- Khả năng phân biệt - Power of discrimination (PD): Chỉ số này cho ta biết khả năng phân biệt giữa 2 cá thể không liên quan được xác định về kiểu gen trong quần thể được nghiên cứu, chỉ số này càng gần tới giá trị 1 thì khả năng phân biệt càng cao. Chỉ số PD có thể đánh giá khả năng truy nguyên cá thể từ dấu vết.
- Khả năng loại trừ - Power of exclusion (PE): Chỉ số này nhằm xác định khả năng ngẫu nhiên 2 cá thể khơng có quan hệ huyết thống mà trên thực tế lại có thể cho nhận các alen, trường hợp điển hình. Chỉ số này tùy thuộc vào từng cá thể; giá trị này càng gần tới 1 thì khả năng nhận định sai về huyết thống trên lý thuyết càng nhỏ.
- Chỉ số quan hệ huyết thống điển hình - Typical paternity index (TPI): Chỉ số phản ánh gấp bao nhiêu lần cá thể đang được phân tích là người cha sinh học, chứ không phải là một cá nhân được lựa chọn ngẫu nhiên. Các chỉ số quan hệ cha con thường được gán cho một locus hơn là một bản hồ sơ ADN của một cá thể. Giá trị này có giá trị nhỏ hơn 1 thì hồn tồn khơng có ý nghĩa trong việc xác định huyết thống cha, mẹ - con.
Sau khi thu được hồ sơ ADN của từng locus, bước tiếp theo, tiến hành tính tốn tần suất alen, tần suất dị hợp tử quan sát, tần suất dị hợp tử lý thuyết và khả năng phân biệt của từng locus theo các công thức sau: [32, 48, 51]
Tần suất dị hợp tử quan sát - Observed Heterozygosity (Hob) hay OH
Tần suất dị hợp tử quan sát H(ob) là tổng tần suất các hồ sơ ADN dị hợp tử quan sát được trong tồn bộ mẫu nghiên cứu. Tần suất này được tính theo cơng thức:
H(ob) = Tổng số cá thể quan sátSố cá thể dị hợp tử
Đồng hợp tử (homozygosity):
∑
Tần suất dị hợp tử lý thuyết - Expected Heterozygosity (Hexp) hay EH
∑
Ví dụ: nếu giả thiết có 3 alen cho một locus gen, ta tính được tần suất của các alen tương ứng là P1 = 0,5; P2 = 0,3 và P3 = 0,2.
H(exp) = 1 - (0,52 + 0,32 + 0,22) H(exp) = 1 - 0,38 = 0,62.
Tóm tắt các cơng thức và tính tốn được sử dụng để tính các tham số khác nhau cho dữ liệu quần thể [27]:
Hiệu quả của số alen - Effective number of alens:
∑
Chỉ số đa hình - Polymorphism information content (PIC):
∑ (∑ ) ∑
Khả năng phân biệt - Power of discrimination (PD):
(∑
) ∑
Khả năng loại trừ - Power of exclusion (PE):
∑ (∑ ) ∑ ∑ ∑ ∑
Ghi chú: pi: Tần suất alen thứ i trên bảng tần suất
2.6. Các chỉ số kết hợp đánh giá giá trị bảng tần suất alen
2.6.1. Chỉ số kết hợp khả năng loại trừ - combined power of exclusion (CPE) (CPE)
Mỗi một bảng tần suất có một giá trị kết hợp khả năng loại trừ khác nhau dựa vào tần suất alen và số alen của bảng tần suất của tộc người mà ta tính được (xem các bảng Mục 3.7). Trong thang đánh giá, các chỉ số PE có giá trị cao có ý nghĩa hơn giá