CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Các mẫu thu thập và chủng vi sinh vật
2.1.1.1. Mẫu thu thập
50 mẫu nghiên cứu đƣợc thu thập trên địa bàn Hà Nội, Nghệ An, Đăklac gồm: 10 mẫu thực phẩm và sản phẩm lên men truyền thống (nƣớc hoa quả lên men, dƣa, cà muối, thịt muối, nem chua), 12 mẫu chất thải chăn nuôi, 11 mẫu phụ phẩm chế biến thực phẩm (rỉ đƣờng, bã ép hoa quả, bã đậu ủ chua làm thức ăn chăn nuôi), 17 mẫu phân ủ, rác thải sinh hoạt, phế phụ phẩm nông nghiệp (rơm rạ, bã nấm).
2.1.1.2. Vi sinh vật
- Vi sinh vật chỉ thị đƣợc dùng để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic gồm:
+ Các VK cùng họ với VK lactic: L. agilis JCM 1230, L. salivarius JCM 5804, L.
plantarum JCM 1048 và JCM1149, Leuconostos mesenteroides,L. fermentum, Streptococcus spp do Phịng Cơng nghệ Vật liệu Sinh học- Viện CNSH cung cấp.
+ Chủng vi khuẩn gây bệnh thối ƣớt khoai tây Erwinia carotovora KT03 do Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp.
+ Các chủng VSV gây bệnh cho ngƣời và vật nuôi: E. coli PA2, E. coli NC,
Salmonella spp, Shigella flexneri, E. faecalis, S. aureus ATCC 29213 do Phòng Vi
khuẩn hiếm gặp- Viện Vệ sinh Dịch tễ TW và Viện CNSH cung cấp.
2.1.2. Hóa chất
K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, CH3COONa, agar, tricin, dextroza, trypsin, α- chymotrysin, proteinaza K, Coomasie Briliant Blue-G250 (Merk, Đức); MgSO4; MgCl2, CaCl2, NaOH, NaCl, axetát kali, axit axêtic, sunphat amôn, glucoza, bộ kit tinh sạch ADN (Qiagen, Đức), SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức), glycerol, agaroza, polyacrylamit, triton X-100, lysozym (Gribco, Mỹ), cao nấm men, pepton, Deoxynucleosit triphosphat (Sigma, Mỹ), carboxymethyl celluloza (Sigma, Mỹ)...
59
2.1.3. Các dung dịch và môi trƣờng 2.1.3.1. Các dung dịch
* Các dung dịch dùng cho tách chiết và điện di ADN
+ Dung dịch I (Sol I): Tris-HCl 25 mM, pH 8, EDTA 10 mM, pH 8, glucoza 50 mM. Dung dịch II (Sol II): NaOH 0,2%; SDS 1%. Dung dịch III (Sol III): kali axêtát 3 M, axit axêtic 5 M.
+ Dung dịch đệm SCED: sorbitol 1 M, xitrat natri 10 mM pH7,5, EDTA 10 mM, DTT 10 mM.
+ Dung dịch đệm TE: Tris HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, pH 8. + Dung dịch chlorofom/isoamylalcohol (24:1).
+ Dung dịch phenol/chlorofom/isoamylalcohol (25:24:1).
+ Dung dịch đệm TAE 50 lần (50X - 100 ml): Tris 24,2%; axit axêtic: 5,71 ml, EDTA 0,5M pH 8: 10 ml.
+ Đệm tra mẫu (loading dye 6X): Bromophenol blue 0,25%, xylen cyanol FF 0,25%, glycerol 30%.
+ Dung dịch nhuộm gel: ethidium fromua (EtBr) 0,5 g/ml.
* Các dung dịch dùng trong điện di protein Tricine-SDS-PAGE
Điện di Tricine-SDS-PAGE đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Schangger [108] bằng các hóa chất và dung dịch sau:
+ Dung dịch acrylamit-bisacrylamit (AB)-3: hòa tan 48 g acrylamit và 1,5 g bisacrylamit (Serva) trong 100 ml nƣớc cất vô trùng, bảo quản ở 7-10o C.
+ Đệm gel (Gel buffer 3X): Tris 3 M, HCl 1 M, SDS 0,3%, chỉnh pH đến 8,45, glycerol, APS 10%, TEMED.
+ Đệm xử lý mẫu (treatment buffer 4X): SDS 12%, mercaptoethanol 6%, glycerol 30%, Coomassie brillliant blue G-250 0,05%, Tris/HCl (pH 7,0) 150 mM.
+ Đệm chạy điện di cực dƣơng: Tris 0,1 M, HCl 0,0225 M, điều chỉnh pH đến 8,9. + Đệm chạy cực âm: Tris 0,1 M, Tricine 0,1 M, SDS 0,1%, chỉnh pH đến 8,25.
Dung dịch dùng trong cố định gel (fixing solution- dùng cho nhuộm bạc và
coomassie): metanol 50%, axit axêtic 10%, axetát amon 100 mM.
60
- Dung dịch nhuộm gel (Coomassie brilliant blue G- CBB): CBB G-250 0,025%;
axit axêtic 10%.
- Dung dịch rửa gel: axit axêtic 10%
- Các dung dịch dùng trong nhuộm bạc: Dung dịch Sensitize: thiosunphat natri
0,005%; Dung dịch bạc: nitrát bạc 0,1%; Dung dịch hiện màu: cacbonat natri 2%; formaldehyt 0,036%; Dung dịch dừng phản ứng: EDTA 50 mM.
Các thành phần của gel Tricine-SDS:
Hóa chất Đơn vị Gel 4% Gel 10% Gel 16%
AB-3 ml 1 6 10 Gel buffer (3X) ml 3 10 10 Glycerol g - 3 3 H20 ml 12 30 30 APS (10%) l 90 150 100 TEMED l 9 15 10 2.1.3.2. Môi trƣờng + Gause Tinh bột tan: 20 g KH2PO4: 0,5 g MgSO4 .7H2O: 0,5 g KNO3 :1 g NaCl : 0,5 g FeSO4 : 0,01 g Nƣớc cất:1000 ml pH: 7,0 + King B Pepton: 20 g Glyxerin: 10 g MgSO4.7H2O: 0,5 g K2HPO4: 1 g + MRS Glucoza: 20 g K2HPO4: 2 g Cao thịt: 1 g Pepton: 10 g Cao nấm men: 4 g CH3COONa: 5 g Triamoni xitrat: 2 g MgSO4.7H2O: 0,2 g MnSO4.4H2O : 0,05 g Tween 80: 1 ml Nƣớc cất: 1000 ml pH: 6,5 + MT sản xuất 1: Rỉ đƣờng: 20 g Cao nấm men: 10 g K2HPO4: 0,2 g Nƣớc sạch: 1.000 ml pH: 6,8- 7,0 + MT sản xuất 2: Nƣớc chiết giá: 40 ml Glucoza:5g Cao nấm men: 5 g Nƣớc sạch: 1000 ml pH: 6,8- 7,0 + MT sản xuất 3: Pepton : 10 g
61 Nƣớc cất: 1000 ml pH: 6,8- 7,0 + Macconkey Macconkey aga : 51,5 g Nƣớc cất: 1000 ml pH = 7,1± 0,2 + SS agar SS aga : 60,0 g Nƣớc cất : 1000 ml pH = 6,8-7,2. + NA Cao thịt bò: 3 g Pepton : 3 g Nƣớc cất: 1000 ml pH: 7,2 + PDA
Nƣớc chiết khoai tây : 200 ml Dextrin: 20 g Nƣớc cất: 800 ml; pH: 6,8. Cao nấm men: 10 g Glucoza: 1 g Nƣớc sạch: 1000 ml pH: 6,8- 7,0 * Môi trƣờng đặc bổ sung aga: 15-20 g/l, khử trùng môi trƣờng ở 121oC/15 phút. 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ
Kính hiển vi điện tử quét Fe-SEM, cân điện tử, bộ chia môi trƣờng (Hitachi, Nhật), tủ cấy vô trùng, tủ ấm, máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ), máy ly tâm lạnh cỡ lớn (Sorvall RC5B, Mỹ), thiết bị lấy mẫu khí SKC Universal PCXR4, máy đo DR2500 (HACH-Mỹ); máy đo pH (Metler, Thụy Sỹ), máy biến tính mẫu, bộ chuyển màng (Bio-Rad, Mỹ), máy Gen Amp PCR System 9700 (ABI, Mỹ), máy
Sequencer ABM Prism 3100-Avant (ABI, Mỹ), máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy ly tâm Eppendorf, bộ điện di đứng và ngang (Bio-Rad, Mỹ), máy biến nạp bằng xung điện, bộ kit tinh sạch ADN từ gel agaroza, máy Speed-Vac, máy điện di protein (Bio-Rad, Mỹ)…
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Phƣơng pháp phân loại
2.2.1.1. Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống:
Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá và khoá phân loại của Bergey [69, 70, 83, 84, 110]
* Xác định đặc điểm hình thái, sinh hố: Đặc điểm khuẩn lạc, khả năng hình thành bào tử, phản ứng catalaza, nhu cầu ơxy, các đặc điểm sinh hoá đƣợc thực hiện theo các phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học thơng thƣờng. Hình ảnh tế bào
62 đƣợc quan sát trên kính hiển vi điện tử quét.
* Xác định khả năng đồng hố các nguồn hydratcacbon: Ni cấy trong môi trƣờng cơ bản đặc hiệu với từng chủng (dạng dịch thể) ở điều kiện thích hợp, thay thế các nguồn hydratcacbon khác nhau. Dựa vào sự chuyển biến màu của dịch nuôi cấy để đánh giá phản ứng dƣơng tính hay âm tính.
2.2.1.2. Phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Là phƣơng pháp phân loại dựa trên giải trình tự gien ADNr 16S. Xác định trình tự ADNr 16S của các chủng vi khuẩn theo phƣơng pháp của Sakiyama và cs năm 2009 [106].
* Tách chiết ADN
- Nguyên tắc: Thành tế bào của VSV đƣợc phá vỡ bởi lyzozim và các chất tẩy
mạnh nhƣ SDS - Tris - HCl giúp ADN đƣợc giải phóng. Protein và ARN đƣợc tách ra khỏi ADN nhờ các enzym xúc tác RNazaA, proteaza K và các dung môi Chlorofom: isoamyl alcohol (24:1). Cuối cùng ADN đƣợc tủa bằng etanol (-220C) tuyệt đối và xác định nồng độ ADN trong dịch mẫu.
- Tiến hành: ADN đƣợc chiết xuất và tách từ sinh khối ƣớt
+ Ly tâm 1.5 ml dịch nuôi vi khuẩn để lấy sinh khối tế bào.
+ Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE ( đệm TE: 15 mM Tris-HCl +1 mM EDTA pH 7,5).
+ Thêm 0,4 mg lyzozim. Trộn đều, ủ 370C/1 giờ. Trộn đều 3 phút.
+ Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 370C/30 phút. + Thêm một thể tích tƣơng đƣơng phenol: clorofom: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 13000 v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.
+ Thêm 8 l ARNaza 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút. + Thêm 12 l proteinaza K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 560C.
+ Thêm một thể tích tƣơng đƣơng phenol: clorofom: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 13000 v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.
63
+ Thêm 1 thể tích tƣơng đƣơng clorofom: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 13000 v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.
+ Thêm 1/ 10 thể tích natri axetat 3M và 1ml etanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút. Ly tâm 13000 v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên.
+ Rửa tủa bằng etanol 70%.
+ Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không. + Hoà tan ADN trong 50-100 l nƣớc hoặc TE.
* Phản ứng khuếch đại ADN (PCR)
- Nguyên tắc: Phƣơng pháp này sử dụng ADN polymeraza và các oligonucleotit
tổng hợp nhân tạo, một đoạn ADN dùng làm khn đƣợc nhân lên nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỷ lần mà không cần đến nhiều tế bào vi khuẩn.
- Tiến hành: + Thành phần phản ứng: Thành phần Thể tích (l) Đệm 10X 10 MgCl2 8 dNTP 2,0 mM 10 Mồi xuôi (10 pmol/l) 2 Mồi ngƣợc (10 pmol/l) 2 Taq polymeraza 2 Template ( khuôn) 1-2 H2O cho đủ 100 + Chu trình nhiệt: 960C - 3 phút 960C - 45giây 550C - 30 giây 35 chu kỳ 720C - 2 phút 720C - 7 phút 40C -
64
+ Primer cặp mồi:
Mồi xuôi : 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. Mồi ngƣợc: 1525R 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'
- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di
Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2 ml, nƣớc cất: 98 ml, agaroza: 1 g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300 ml dung dịch 1 X TAE, trộn 2 l dung dịch 6X với 5 l mẫu trộn đều,
nhỏ vào giếng, chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.
* Tinh sạch sản phẩm PCR
- Sử dụng bộ kit QIA gien theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
+ Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều. + Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút. + Đổ bỏ dịch phía dƣới cột.
+ Bổ sung 750 l dung dịch đệm PE lên cột. Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút + Đổ bỏ dịch dƣới cột.
+ Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút. + Chuyển cột sang ống Eppendoft mới.
+ Thêm 30 l nƣớc. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. + Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút.
+ Lấy dịch phía dƣới.
- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu: Kiểm tra độ hấp phụ trên máy quang phổ ở các bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. AND sạch khi tỷ lệ A260/A280 > 1,7.
* Phản ứng khuếch đại cho chuỗi trình tự ADN
- Hịa hợp phản ứng của các gien kết thúc có sẵn (Termix): Dung dịch đệm 5X 9 l
Trộn lẫn phản ứng có sẵn Bigdye 18 l H2O 9 l
65 - Thành phần phản ứng PCR cho chuỗi: Termix 8 l Cặp mồi (*) 1 l Khuôn 1 l ( nồng độ ADN là 40-60 g/ml) H2O 10 l (*) Các loại mồi đã sử dụng: 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'. 780F: 5'- GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R: 5'- CTGCTGCCTCCCGTAG-3'. 1100F: 5'- GCAACGAGCGCAACCC-3'. 920R: 5'- GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'. - Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gien:
960C - 1 phút 960C - 10 giây
500C - 5 giây 25 chu kỳ 600C - 4 phút
* Tinh sạch sản phẩm PCR cho xác định trình tự
- Chuyển 20 l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch
- Thêm 5 l EDTA 125 mM và 60l etanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 13.000 v/p, 15phút
- Bỏ dịch, thêm 60 l etanol 70% để rửa, ly tâm 15000 v/p, 10 phút - Làm khô.
- Thêm 10 l HiDi formamit - Để ở 960C trong 2 phút.
- Cho ngay mẫu vào nƣớc đá lạnh.
- Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho xác định trình tự. - Vận hành máy xác định trình tự gien ABI 3100 Avant.
66
* Đọc trình tự ADN và xây dựng cây phân loại
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động (ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer-Mỹ). Kết quả đọc trình tự đƣợc xử lý trên phần mềm Clustal X. Các trình tự đƣợc so sánh với trình tự ADNr 16S của các lồi đã đƣợc cơng bố từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Xây dựng cây phát sinh chủng loại, phân tích Bootstrap đƣợc thực hiện từ 1000 lần lặp lại ngẫu nhiên. Tên loài vi sinh vật đƣợc xác định với xác suất tƣơng đồng cao nhất.
2.2.2. Xác định hoạt tính sinh học của vi sinh vật 2.2.2.1. Hoạt tính xenlulaza, amylaza, proteaza 2.2.2.1. Hoạt tính xenlulaza, amylaza, proteaza
- Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán enzym trên môi trƣờng thạch đĩa [83, 84]. -Tiến hành: Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng đặc hiệu dạng
dịch thể trong điều kiện thích hợp, chiết dịch enzym thơ. Sử dụng môi trƣờng thạch 0,1% cazein (để xác định hoạt tính proteaza) hoặc CMC, bột giấy (để xác định hoạt tính xenlulaza) hoặc tinh bột (để xác định hoạt tính amylaza) đổ ra đĩa Petri để khơ và đục lỗ bằng dụng cụ khoan lỗ thạch, dùng 50-100 l dịch enzym thô cho mỗi
giếng. Enzym đƣợc khuếch tán ở 4oC trong 6 giờ. Sau đó ủ ở nhiệt độ 35-37oC trong 6 giờ.
+ Xác định hoạt tính proteaza bằng khả năng tạo vịng trong suốt do proteaza phân giải cơ chất cazein.
+ Xác định hoạt tính xenlulaza, amylaza bằng cách nhuộm dung dịch Lugol:
* Phần CMC, bột giấy bị enzym xenlulaza phân giải tạo vịng trong suốt khơng bắt màu với dung dịch Lugol. Phần khơng bị phân giải có màu đỏ do CMC, bột giấy tạo màu với Lugo.
* Phần tinh bột bị enzym amylaza phân giải tạo vịng trong suốt khơng bắt màu với dung dịch Lugol. Phần khơng bị phân giải có màu tím do tinh bột tạo màu với Lugol.
Xác định kích thƣớc vịng phân giải= (D- d, mm); Trong đó D: Đƣờng kính vịng phân giải;
d: Đƣờng kính lỗ đục.
67
2.2.2.2. Nghiên cứu đặc tính của proteaza
* Xác định hoạt độ proteaza theo phương pháp Anson cải tiến
Một đơn vị hoạt động proteaza (HP) là lƣợng enzym có khả năng phân giải protein trong 1 phút ở 300C và pH thích hợp tạo thành các sản phẩm hoà tan trong axit tricloaxetic (TCA). Cho phản ứng mầu với thuốc thử Folin-Ciocalteu tƣơng đƣơng với 1micromol tyrozin [Theo 19, 20].
Hỗn hợp thí nghiệm bao gồm 0,5ml dung dịch enzym, 1 ml cơ chất giữ ở 300C trong 20 phút. Dừng phản ứng bằng 2,5 ml dung dịch axit tricloaxetic (TCA) 5%, lắc đều, giữ ở 30phút. Mẫu kiểm tra cho TCA vào dung dịch enzym trƣớc khi cho cơ chất. Sản phẩm phản ứng đƣợc xác định bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, so màu trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 750 nm.
Lấy hiệu số số đọc trên máy giữa ống thí nghiệm và ống kiểm tra. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrozin để tính micromol tyrozin tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm tạo thành dƣới tác dụng của enzym. Hoạt độ phân giải protein của 1ml dung dịch enzym mẫu (PA) cần xác định đƣợc tính theo cơng thức.
HP/ml = ( micromol Tyr x 4 x 2) /t = Đơn vị phản ứng 4: Tồn bộ thể tích hỗn hợp phản ứng
2: Tính trên 1 ml dung dịch enzym đem xác định t: thời gian ủ enzym với cơ chất
* Nghiên cứu độ bền của proteaza
- Ảnh hưởng của các ion kim loại: Thu enzym từ dịch nuôi cấy vi khuẩn, bổ sung
các ion kim loại với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng bằng 10-3M. Sau 10 phút xác định lại hoạt độ của enzym. Lấy giá trị hoạt độ của enzym ban đầu làm đối chứng, coi giá trị đó là 100% để so sánh với các giá trị đƣợc xác định sau khi ủ enzym đƣợc bổ sung các ion kim loại khác nhau [Theo 7, 19, 20].
2.2.2.3. Định lƣợng đƣờng khử theo Micro-Bertrand
- Nguyên tắc: Trong môi trƣờng kiềm các đƣờng khử (glucoza, fructoza..) có thể dễ
dàng khử đồng 2 oxit thành đồng 1 oxit (Cu2 Cu), kết tủa đồng oxit có màu đỏ gạch, qua đó tính đƣợc lƣợng đƣờng khử.
68
- Chuẩn bị các dung dịch:
+ Dung dịch Fehling A: 4% CuSO4. 5H2O.
+ Dung dịch Fehling B: C4H4KNaO6: 200 g, NaOH: 150 g, nƣớc tới 1000 ml.