CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN
3.2.4.1. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn gây thố
* Đối kháng vi khuẩn gây bệnh
Một trong những nguồn nhiễm vi khuẩn gây bệnh Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, E. coli (serotype gây độc) là từ chất bài tiết của vật nuôi bị
bệnh thƣơng hàn, ỉa chảy, viêm mủ, nhiễm trùng huyết…Vì ln có mặt trong phân tƣơi nên E. coli đƣợc coi là vi khuẩn chỉ thị về độ sạch, độ nhiễm phân của nông sản
108
hay đất, nƣớc. Theo tiêu chuẩn đƣợc qui định trong quyết định số 100/2008 QĐ- BNN, Salmonella và E. coli khơng đƣợc có mặt trong phân bón hữu cơ. Vì vậy, để tạo ra chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi, giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng và cung cấp nguồn phân bón hữu cơ phục vụ sản xuất nơng sản sạch, an tồn, nghiên cứu đặc biệt quan tâm đến hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh của chủng vi khuẩn lactic.
Các thí nghiệm xác định khả năng đối kháng một số vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và vật nuôi của chủng vi khuẩn LH19 đƣợc thực hiện với sự giúp đỡ về kỹ thuật và chủng kiểm định của Viện Vệ sinh dịch tễ TW. Các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy riêng rẽ sau 48 giờ trong môi trƣờng dịch thể ở điều kiện thích hợp, cho tiếp xúc trực tiếp vi khuẩn lactic với từng chủng vi khuẩn kiểm định, xác định khả năng tồn tại của mỗi chủng trong hỗn hợp sau các khoảng thời gian nhất định. Kết quả thể hiện ở bảng 3.14 và hình 3.22.
Bảng 3.14. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và vật nuôi của chủng LH19
Chủng kiểm
định đầu (CFU/ml) Mật độ ban Mật độ vi khuẩn gây bệnh sau khi tiếp xúc với chủng LH19 theo thời gian (CFU/ml) 6 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ
E. coli 4,8 x 106 6,3 x 104 1,8 x 104 1,4 x 104 -
Salmonella sp 3,5 x 106 2,7 x 104 1,5 x 104 1,0 x 104 -
Shigella sp 3,8 x 106 7,0 x 103 - - -
S. aureus 3,6 x 106 6,2 x 103 - - -
(-): Khơng xác định được ở nồng độ pha lỗng 10-1
Kết quả cho thấy chủng LH19 đối kháng cả 4 chủng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm, thời gian ức chế nhanh (sau 6 giờ tiếp xúc, mật độ tế bào các vi khuẩn gây bệnh đều giảm mạnh, Shigella sp , Staphylococcus giảm từ 106 xuống 103 CFU/ml;
E. coli và Salmonella sp giảm từ 106 xuống 104 CFU/ml).
Khả năng đối kháng của LH19 nhanh và mạnh nhất với Shigella sp,
Staphylococcus aureus (24 giờ tiếp xúc). Khả năng đối kháng E. coli và Salmonella
109
sp của LH19 cũng đƣợc khẳng định ở 72 giờ tiếp xúc trực tiếp (Không xác định đƣợc E. coli và Salmonella sp ở độ pha loãng 10-1).
CT 0h 6h 24h 48h 72h
E.coli
Salmonella sp
Shigella sp
Hình 3.22. Khả năng đối kháng E. coli, Salmonella, Shigella của chủng LH19
* Đối kháng vi khuẩn gây thối rữa
Erwinia carotovora KT03 là chủng vi khuẩn gây thối nhũn khoai tây, thuộc
chi Erwinia là vi khuẩn gây thối, sinh khí H2S. Chủng vi khuẩn LH19 và E. carotovora KT03 đƣợc nuôi cấy riêng rẽ sau 48 giờ trong môi trƣờng dịch thể ở điều kiện sinh trƣởng phù hợp với mỗi chủng. Cho tiếp xúc dịch thể ở nồng độ 106 và 108 CFU/ml, xác định khả năng tồn tại của mỗi chủng trong hỗn hợp.
Bảng 3.15. Khả năng đối kháng E. carotovora KT03 của chủng LH19
Nồng độ tiếp xúc Chủng VK Mật độ ban đầu (CFU/ml) Mật độ tế bào các chủng VSV sau khi tiếp xúc theo thời gian (CFU/ml)
24 giờ 48 giờ 72 giờ
108 E.carotovora KT03 1,6 x 108 3,6 x 104 - -
LH19 1,4 x 108 2,2 x 108 4,6 x 108 3,08 x 108
106 E.carotovora KT03 3,2 x 106 1,06 x 104 - -
LH19 3,0 x 106 6,8 x 106 1,52 x 107 1,4 x 107
(-): Khơng tìm thấy khuẩn lạc ở nồng độ pha lỗng 10-1
110
Kết quả thử nghiệm cho thấy, chủng LH19 đối kháng mạnh với E. carotovora KT03. Sau 24 giờ tiếp xúc mật độ tế bào chủng E. carotovora KT03 đã
giảm từ 108 hoặc 106 xuống 104 CFU/ml và sau 48 giờ không xác định đƣợc E. carotovora KT03 trong hỗn hợp.
Từ kết quả tại các bảng 3.14 và 3.15 có thể nhận thấy bổ sung chủng LH19 vào chế phẩm xử lý chất thải chăn ni sẽ có hiệu quả cao trong xử lý các nhóm vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn gây thối. Do có khả năng kháng khuẩn nhanh (sau 6-48 giờ) nên trong quá trình ủ phân, giai đoạn đầu thì nhiệt độ tăng ở mức phù hợp cho vi khuẩn ƣa ấm phát triển, chủng LH19 sẽ sinh trƣởng mạnh và tiêu diệt đƣợc nhóm vi khuẩn gây thối rữa và vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột do đó làm giảm nhanh chóng khí phát thải có mùi hơi thối và nguy cơ lan truyền mầm bệnh.
3.2.4.2. Khả năng tổng hợp bacterioxin của vi khuẩn lactic LH19
Ngoài axit lactic là tác nhân diệt khuẩn, liệu chủng LH19 có khả năng tổng hợp protein kháng khuẩn hay không? Các thử nghiệm xác định khả năng tổng hợp bacterioxin của chủng LH19 đã đƣợc tiến hành để tìm hiểu rõ yếu tố kháng khuẩn của chủng LH19.
* Xác định phổ kháng khuẩn
Mục tiêu của thí nghiệm là tìm phổ kháng khuẩn của chủng LH19 trong điều kiện sinh trƣởng và của dịch ly tâm đã đƣợc trung hòa pH để làm giảm tác động kháng khuẩn của axit lactic. Từ đó xác định đƣợc yếu tố kháng khuẩn của LH19.
Căn cứ vào các cơng trình nghiên cứu đã đƣợc cơng bố về bacterioxin của vi khuẩn lactic [45, 46, 58, 79, 95], tiến hành lựa chọn bộ chủng giống vi khuẩn kiểm định có cùng họ hàng hoặc cạnh tranh về dinh dƣỡng hoặc môi trƣờng cƣ trú.
Kết quả đánh giá nhanh phổ kháng khuẩn của LH19 bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch và cấy chấm điểm (đƣợc tổng hợp trong bảng 3.16 và minh họa tại các hình 3.23) cho thấy: Chủng LH19 có phổ ức chế tƣơng đối rộng với các chủng kiểm định thuộc cả vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-). Khi điều chỉnh dịch nuôi cấy về pH trung tính để loại bỏ tác động của axit lactic thì phổ ức chế bị thu hẹp lại, trong khi khả năng ức chế một số vi khuẩn Gram (-) giảm xuống rõ rệt, vòng ức chế mờ,
111
hầu hết nhỏ hơn 10 mm thì dịch ni cấy đã trung hịa vẫn ức chế mạnh nhóm Gram (+) trong đó có các chủng gây bệnh nhƣ E. faecalis và S. aureus và khá nhiều loài vi khuẩn lactic nhƣng lại không ức chế các chủng L. plantarum là vi khuẩn sinh ra bacterioxin đó.
Bảng 3.16. Phổ kháng khuẩn của chủng LH19 Các chủng kiểm định
Hoạt tính ức chế đối với các VSV kiểm định
Trong điều kiện sinh trƣởng Điều chỉnh pH trung tính Ni trên thạch (Cấy chấm điểm) Dịch ni cấy (Đục lỗ thạch) Nhóm Gram dƣơng: Lactobacillus agilis JCM 1230 + + + L. salivarius JCM 5804 + + + L. fermentum + + + L. plantarum JCM 1048 - - - L. plantarum JCM 1149 - - - Leuconostos mesenteroides - - - Streptococcus spp. + + + Enterococcus faecalis + + +
Staphylococcus aureus ATCC 29213 + + +
Nhóm Gram âm: E. coli NC + + +/- Salmonella spp. + + +/- Erwinia carotovora KT03 + + + Chú thích: (+): Có ức chế; (-) : Không ức chế; (+/-): Ức chế yếu (D-d)<10mm Kháng L. fermentum Không kháng L. plantarum JCM 1048 Kháng L. salivarius Kháng E. carotovora KT03 Kháng E. faecalis
Hình 3.23. Hoạt tính kháng của LH19 với các chủng vi khuẩn kiểm định Kết quả thử nghiệm này rất có ý nghĩa, phù hợp với các kết quả nghiên cứu
112
trƣớc đây [36, 38, 42, 99] cho phép đƣa ra khả năng chủng L. plantarum LH19 sinh tổng hợp bacterioxin.
* Xác định bản chất của chất kháng khuẩn
Để khẳng định bản chất của bacterioxin của vi khuẩn lactic có phải là protein hay không, tiến hành nuôi cấy vi khuẩn LH19 trong môi trƣờng MRS dịch thể, sau 14 giờ đem ly tâm để thu dịch nổi. Điều chỉnh pH của dịch thu đƣợc về 6,5 sau đó xử lý với các enzym proteaza (nồng độ 0.2 mg ml-1) theo tỉ lệ 1:1. Mẫu đối chứng là dịch nuôi cấy vi khuẩn với đệm phốt phát theo tỷ lệ (1:1).
Các mẫu thí nghiệm đƣợc ủ ở 37oC trong 2 giờ, dừng phản ứng bằng tác động nhiệt. Sau đó, tiến hành thử hoạt tính của mẫu theo phƣơng pháp khuếch tán trên thạch. Sự nhạy cảm với enzym thể hiện qua việc mẫu bị mất hoặc giảm hoạt tính kháng khuẩn với Staphylococcus aureus ATCC 29213. Nếu tại các giếng mẫu không xuất hiện vịng vơ khuẩn hoặc kích thứơc vịng vơ khuẩn giảm đi so với mẫu đối chứng, chứng tỏ đã xảy ra phản ứng thuỷ phân protein, nhƣ vậy chất kháng khuẩn trong mẫu nghiên cứu có bản chất là protein. Kết quả tại bảng 3.17 và hình 3.24.
Bảng 3.17. Phản ứng của dịch chứa chất kháng khuẩn với các enzym phân giải protein
Phản ứng với enzym (0,2 mg/ml)
Trypxin (1) Pepxin (2) α-chymotrypxin (3) Pronaza (4) Proteinaza K (5) Đối chứng (6)
+ - +/- +/- - -
Chú thích: (+): Mất hoạt tính; (-): Khơng mất hoạt tính; (+/-): Giảm hoạt tính
Các enzym phân giải protein 1: Trypxin 2: Pepxin 3: α-chymotrypsin 4: Pronaza 5: Proteinaza K
6: Đối chứng Hình 3.24. Phản ứng của dịch bacterioxin với các
enzym phân giải protein (chủng kiểm định là S. aureus)
113
Kết quả cho thấy chất kháng khuẩn do chủng LH19 tổng hợp nhạy cảm với các enzym thuỷ phân protein. Độ nhạy cảm cao nhất đối với trypxin, yếu hơn với α- chymotrypxin và khơng có phản ứng với pepxin và proteinaza K. Kết quả này chứng minh bản chất protein của mẫu thử bacterioxin do chủng LH19 tổng hợp.
* Xác định kích thước, phân nhóm của bacterioxin
Bacterioxin của vi khuẩn L. plantarum thƣờng thuộc phân lớp IIa có kích
thƣớc <10 kDa [103, 104, 105], vì vậy tiến hành điện di trên gel Tripcine SDS- PAGE [108].
- Điện di đồ xác định kích thước bacterioxin
Dịch protein đƣợc bổ sung đệm, xử lý mẫu và biến tính ở 37oC trong 30 phút. Lắp bản gel, tra mẫu vào các giếng và chạy với cƣờng độ dòng cố định 10 mA trong khoảng 15 phút. Sau đó tăng cƣờng độ dòng điện lên 40 mA và tiếp tục điện di trong khoảng 45 phút. Với điện di trixin, bắt đầu chạy với hiệu điện thế 30 V cho đến khi mẫu chạy hết gel cơ, sau đó tăng lên 180 V cho đến hết bản gel. Nhẹ nhàng gỡ bản gel và nhuộm bằng coomasie brilliant blue hoặc nhuộm bạc. Trên bản gel mẫu bacterioxin của chủng LH19 đƣợc tra lặp lại 2 lần.
Dừng chạy khi thuốc nhuộm cách đáy 0,5 cm, cắt đơi bản gel, nửa có gien đánh dấu đƣợc nhuộm Coomasie brilliant blue, nửa còn lại đƣợc rửa với 35% cồn, 2% glycerol 30 ÷ 60 phút, rửa nƣớc cất vơ trùng từ 15 ÷ 30 phút, để xác định hoạt tính kháng khuẩn .
- Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn:
Sau khi điện di, nửa bản gel đã đƣợc rửa để xác định hoạt tính kháng khuẩn đƣợc đặt lên đĩa Petri vơ trùng đã có sẵn 1 lớp thạch, sau đó đổ 1 lớp thạch bán lỏng có chứa chủng kiểm định S. aureus. Úp ngƣợc đĩa để trong tủ lạnh 4 giờ, sau đó
ni 300C trong 24 giờ. Kết quả thể hiện trên hình 3.25.
Kết quả điện di cho thấy, bacterioxin do chủng LH19 tổng hợp có khối lƣợng phân tử khoảng 3,5 kDa. Kết quả xác định hoạt tính đối kháng của bacterioxin tại bản gel sau điện di đối với chủng kiểm định S. aureus đã khẳng định kết quả này.
114
A: Điện di trên gel acrylamit 16%
1: Thang protein chuẩn; 2: Tủa bacterioxin từ
dịch nuôi cấy
B: Vùng ức chế S.aureus do bacterioxin từ bản gel tạo ra .
Hình 3.25. Điện di tricine SDS- PAGE xác định kích thƣớc và kiểm tra hoạt tính bacterioxin của chủng LH19
* Xác định độ bền của bacterioxin
Để xác định độ bền của bacterioxin, chủng LH19 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dịch thể MRS trong 48 giờ, thu hồi bacterioxin và thử hoạt tính kháng khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau theo thời gian và tƣơng tác với axit ở các pH khác nhau.
Bảng 3.18. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian đến hoạt tính bacterioxin
Thời gian (phút) Hoạt tính kháng khuẩn ở các nhiệt độ (0C)
4 25 60 80 -20 5 + + + + + 10 + + + + + 15 + + + + + 20 + + + + + 30 + + + + + 60 + + + + + 120 + + + +/- +
Chú thích: (+): Khơng mất hoạt tính; (-): Mất hoạt tính; (+/-): Giảm hoạt tính
Kết quả bảng 3.18 cho thấy, trong khoảng nhiệt độ <800C và -200C, hoạt tính của bacterioxin duy trì trong 120 phút. Đặc biệt vẫn có hoạt tính kháng khuẩn ở
115
800C trong vòng 60 phút và giảm hoạt tính trong 120 phút. Nhƣ vậy, bacterioxin chủng LH19 thuộc loại bền với nhiệt độ.
Bảng 3.19. Hoạt tính của bacterioxin ở các pH khác nhau
pH 2 4 6 7 8 9 10
Hoạt tính kháng khuẩn + + + + +/- - -
Chú thích: (+): Khơng mất hoạt tính; (-): Mất hoạt tính;
Kết quả ở bảng 3.19 cho thấy, bacterioxin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trong khoảng pH từ axit (2,0) đến trung tính (7,0), đây là một đặc điểm mà nhiều bacterioxin khơng có (nhƣ nisin chủ yếu thể hiện hoạt tính trong vùng axit) [45, 46, 58, 102, 103].
Từ các kết quả nghiên cứu trên đã xác định chủng vi khuẩn lactic ký hiệu LH19 có khả năng ức chế, tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn gây thối rữa thông qua khả năng sinh tổng hợp axit lactic và bacterioxin. Bacterioxin của chủng LH19 có nhiều đặc điểm giống nhóm plantaricin C, có khối lƣợng phân tử khoảng 3,5 kDa, nhạy cảm với trypxin, α-chymotrypxin; khá bền với nhiệt và hoạt động ở phổ pH từ axit đến trung tính.
Nhƣ vậy sử dụng chủng LH19 trong sản xuất chế phẩm vi sinh vật tƣơng đối phù hợp trong điều kiện xử lý chất thải chăn ni và có ý nghĩa quan trọng trong việc tiêu diệt các mầm bệnh và nguồn gốc phát thải các khí có mùi hơi thối trong chất thải chăn nuôi.
3.2.4.3. Một số yếu tố mơi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng LH19
* Ảnh hưởng của nhiệt độ
Xác định nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng LH19 là cần thiết và nhiệt độ là một trong các yếu tố ảnh hƣởng nhiều đến sinh trƣởng và hoạt tính của vi khuẩn lactic. Chủng LH19 đƣợc nuôi lắc, ổn nhiệt trong môi trƣờng dịch thể MRS ở các nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 40, 45, 500C, trong thời gian 48 giờ. Xác định khả năng sinh trƣởng, tổng hợp axit lactic và khả năng kháng E. carotovora KT03 của dịch nuôi cấy chủng LH19.
116
Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng và hoạt tính kháng khuẩn của chủng LH19 Nhiệt độ nuôi (0C) Khả năng sinh trƣởng (OD, 600 nm) Hàm lƣợng axit lactíc (mg/ml) Kích thƣớc vịng kháng khuẩn (D-d, mm) 25 1,8 14,8 14 30 2,2 23,5 19 35 3,2 27,9 22 40 2,3 21,2 17 45 1,2 8,4 8 50 0,7 5,0 6
Kết quả bảng 3.20 cho thấy: Chủng vi khuẩn lactic LH19 thể hiện hoạt tính đối kháng với E. carotovora KT03 trong dải nhiệt độ 25- 500C. Khoảng nhiệt độ 30-400C là thích hợp đối với khả năng sinh trƣởng cũng nhƣ sinh tổng hợp axit lactic và đối kháng chủng vi khuẩn E. carotovora KT03, trong đó 350C là nhiệt độ thích hợp nhất. Ở nhiệt độ 350C, mật độ quang (OD), hàm lƣợng axit lactic, kích thƣớc vịng vơ khuẩn đều đạt mức cao nhất ( tƣơng ứng là 3,2, 27,9 mg/ml và 22 mm). Khả năng sinh trƣởng, tổng hợp axit lactic và đối kháng của chủng LH19 giảm nhanh ở nhiệt độ 450C và 500C, tuy nhiên cũng vẫn có khả năng đối kháng ở mức độ nhất định.
Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác [49, 52, 77]. Mặc dù khơng hình thành bào tử nhƣng vi khuẩn lactic vẫn có thể tồn tại và sinh trƣởng trong điều kiện nhiệt độ dƣới 150C và trên 400C, do đó chủng vi khuẩn lactic LH19 sẽ sinh trƣởng, tổng hợp các chất kháng khuẩn và hoạt động hiệu quả trong vòng 3 ngày đầu khi nhiệt độ đống ủ <500C nhƣng vẫn tồn tại trong đống ủ trong suốt quá trình xử lý.
* Ảnh hưởng của pH
Chủng LH19 đƣợc nuôi lắc trong mơi trƣờng và điều kiện thích hợp trong 48 giờ. pH mơi trƣờng đƣợc điều chỉnh và ổn định bằng dung dịch đệm ở các giá trị
117
khác nhau từ 4,0 đến 9,0. Xác định khả năng sinh trƣởng, sinh tổng hợp axit lactic và khả năng đối kháng E. carotovora KT03 của dịch nuôi cấy chủng LH19.
Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng và hoạt tính kháng khuẩn của chủng LH19
pH Khả năng sinh trƣởng (OD, 600 nm) Hàm lƣợng axit lactíc (mg/ml) Kích thƣớc vịng kháng