Xác định hoạt tính sinh học của vi sinh vật

CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.2.2. Xác định hoạt tính sinh học của vi sinh vật

2.2.2.1. Hoạt tính xenlulaza, amylaza, proteaza

- Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán enzym trên môi trƣờng thạch đĩa [83, 84]. -Tiến hành: Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng đặc hiệu dạng

dịch thể trong điều kiện thích hợp, chiết dịch enzym thơ. Sử dụng môi trƣờng thạch 0,1% cazein (để xác định hoạt tính proteaza) hoặc CMC, bột giấy (để xác định hoạt tính xenlulaza) hoặc tinh bột (để xác định hoạt tính amylaza) đổ ra đĩa Petri để khơ và đục lỗ bằng dụng cụ khoan lỗ thạch, dùng 50-100 l dịch enzym thô cho mỗi

giếng. Enzym đƣợc khuếch tán ở 4oC trong 6 giờ. Sau đó ủ ở nhiệt độ 35-37oC trong 6 giờ.

+ Xác định hoạt tính proteaza bằng khả năng tạo vịng trong suốt do proteaza phân giải cơ chất cazein.

+ Xác định hoạt tính xenlulaza, amylaza bằng cách nhuộm dung dịch Lugol:

* Phần CMC, bột giấy bị enzym xenlulaza phân giải tạo vòng trong suốt không bắt màu với dung dịch Lugol. Phần khơng bị phân giải có màu đỏ do CMC, bột giấy tạo màu với Lugo.

* Phần tinh bột bị enzym amylaza phân giải tạo vòng trong suốt không bắt màu với dung dịch Lugol. Phần khơng bị phân giải có màu tím do tinh bột tạo màu với Lugol.

Xác định kích thƣớc vịng phân giải= (D- d, mm); Trong đó D: Đƣờng kính vịng phân giải;

d: Đƣờng kính lỗ đục.

67

2.2.2.2. Nghiên cứu đặc tính của proteaza

* Xác định hoạt độ proteaza theo phương pháp Anson cải tiến

Một đơn vị hoạt động proteaza (HP) là lƣợng enzym có khả năng phân giải protein trong 1 phút ở 300C và pH thích hợp tạo thành các sản phẩm hồ tan trong axit tricloaxetic (TCA). Cho phản ứng mầu với thuốc thử Folin-Ciocalteu tƣơng đƣơng với 1micromol tyrozin [Theo 19, 20].

Hỗn hợp thí nghiệm bao gồm 0,5ml dung dịch enzym, 1 ml cơ chất giữ ở 300C trong 20 phút. Dừng phản ứng bằng 2,5 ml dung dịch axit tricloaxetic (TCA) 5%, lắc đều, giữ ở 30phút. Mẫu kiểm tra cho TCA vào dung dịch enzym trƣớc khi cho cơ chất. Sản phẩm phản ứng đƣợc xác định bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, so màu trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 750 nm.

Lấy hiệu số số đọc trên máy giữa ống thí nghiệm và ống kiểm tra. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrozin để tính micromol tyrozin tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm tạo thành dƣới tác dụng của enzym. Hoạt độ phân giải protein của 1ml dung dịch enzym mẫu (PA) cần xác định đƣợc tính theo cơng thức.

HP/ml = ( micromol Tyr x 4 x 2) /t = Đơn vị phản ứng 4: Tồn bộ thể tích hỗn hợp phản ứng

2: Tính trên 1 ml dung dịch enzym đem xác định t: thời gian ủ enzym với cơ chất

* Nghiên cứu độ bền của proteaza

- Ảnh hưởng của các ion kim loại: Thu enzym từ dịch nuôi cấy vi khuẩn, bổ sung

các ion kim loại với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng bằng 10-3M. Sau 10 phút xác định lại hoạt độ của enzym. Lấy giá trị hoạt độ của enzym ban đầu làm đối chứng, coi giá trị đó là 100% để so sánh với các giá trị đƣợc xác định sau khi ủ enzym đƣợc bổ sung các ion kim loại khác nhau [Theo 7, 19, 20].

2.2.2.3. Định lƣợng đƣờng khử theo Micro-Bertrand

- Nguyên tắc: Trong môi trƣờng kiềm các đƣờng khử (glucoza, fructoza..) có thể dễ

dàng khử đồng 2 oxit thành đồng 1 oxit (Cu2  Cu), kết tủa đồng oxit có màu đỏ gạch, qua đó tính đƣợc lƣợng đƣờng khử.

68

- Chuẩn bị các dung dịch:

+ Dung dịch Fehling A: 4% CuSO4. 5H2O.

+ Dung dịch Fehling B: C4H4KNaO6: 200 g, NaOH: 150 g, nƣớc tới 1000 ml. + Dung dịch C: Fe2(SO4)3. H2O: 50 g; H2SO4 (d=1,84): 20 g, nƣớc tới 1000 ml. + Dung dịch D: KMnO4 1/30N.

- Tiến hành: Lấy 3 ml mẫu, thêm vào 3 ml dung dịch A và 3 ml dung dịch B. Trộn

đều và đun sôi cách thuỷ trong 10 phút, loại dịch. Thêm 3 ml dung dịch C vào kết tủa, lắc tan đều. Chuẩn độ với dung dịch KMnO4 khi xuất hiện màu hồng nhạt bền 30 giây. Tính số ml dung dịch KMnO4, lƣợng đƣờng khử theo bảng Micro-Bertrand.

2.2.2.4. Xác định khả năng tổng hợp axit lactic

- Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính là CaCO3 sẽ bị tan khi tác dụng với axit lactic tạo

nên vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc.

- Tiến hành: Lấy 1 ml từ mẫu ni cấy VK lactic, pha lỗng ở nồng độ thích hợp

(10-3-10-6). Nhỏ 0,05 ml mẫu vào đĩa Petri chứa môi trƣờng thạch MRS, có bổ sung 0,5 g CaCO3/lít, gạt đều trên mặt thạch, sau đó phủ tiếp một lớp thạch mỏng lên trên để tạo điều kiện kỵ khí. Ni ở 35±2oC trong 48 giờ. Xác định khả năng sinh axit lactic bằng sự xuất hiện các vùng sáng xung quanh khuẩn lạc do phân giải CaCO3.

2.2.2.5. Định lƣợng axit lactic theo Therner

- Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng hấp phụ màu của dịch axit lactic mà vi khuẩn sinh

ra với phenolphatelein, xác định đƣợc hàm lƣợng axit lactic của mẫu [7, 86, 92].

- Tiến hành: Lấy 10 ml dịch lên men, bổ sung 20 ml nƣớc cất và thêm 1 đến 2 giọt

phenolphatalein (nồng độ 1% trong cồn 900). Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại số ml NaOH 0,1 N đã dùng để chuẩn độ.

Độ axit đƣợc tính nhƣ sau:

0T = VNaOHtiêu tốn  10 % axit lactic = 0T  0,009

*Chú thích: 0T: Độ Therner, một độ Therner tƣơng ứng với 9 mg axit lactic.

69

2.2.2.6. Xác định khả năng kháng khuẩn trên môi trƣờng thạch đĩa

Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic

LH19 trên thạch đĩa tạo ra vòng ức chế để đánh giá khả năng kháng khuẩn tại thời điểm nuôi nhất định.

* Phương pháp cấy chấm điểm

Chủng vi khuẩn lactic đƣợc cấy chấm điểm trên môi trƣờng MRS thạch đĩa ở nhiệt độ 30±2oC trong thời gian 18 giờ. Sau đó, phủ lên trên bề mặt thạch từng chủng kiểm định đã nuôi riêng rẽ qua đêm trong môi trƣờng nuôi cấy bán lỏng. Sau khi để ở nhiệt độ 40C từ 4 đến 8 giờ, chuyển sang nhiệt độ thích hợp tùy chủng kiểm định, nuôi trong thời gian 18 giờ , xác định hoạt tính ức chế thơng qua vịng ức chế [Theo 5, 13, 99].

* Phương pháp đục lỗ thạch

Trộn lẫn vi khuẩn kiểm định với môi trƣờng thạch thƣờng ở nhiệt độ khoảng 40- 450C. Sau đó, đổ ra đĩa Petri, để thạch đơng, khi bề mặt khơ thì tiến hành đục lỗ thạch bằng nút khoan. Chủng LH19 đƣợc nuôi trong môi trƣờng dịch thể, ở 30±2oC trong 48 giờ. Nhỏ 0,05 ml dịch mẫu vào các giếng, giữ ở 40C từ 4-8 giờ để dịch khuếch tán đều ra thạch. Chuyển sang ủ ở nhiệt độ thích hợp tùy chủng kiểm định trong 18 giờ. Hoạt tính kháng khuẩn đƣợc tính bằng kích thƣớc vịng vơ khuẩn: (D- d, mm) với D: Đƣờng kính vịng vơ khuẩn; d: Đƣờng kính lỗ thạch [Theo 11, 13, 43, 87, 99].

2.2.2.7. Xác định khả năng kháng khuẩn trong môi trƣờng dịch thể

Dịch vi khuẩn LH19 đƣơ ̣c thêm vào dịch vi khuẩn kiểm định (E. coli, Salmonella, Shigella, S. aureus, Erwinia…) đang sinh trƣởng ở pha log có nồng độ

tƣơng đƣơng (108 CFU/ml). Nuôi cấy hỗn hợp ở 35±20C. Sau nhƣ̃ng khoảng thời gian nhất đi ̣nh (6, 12, 24, 48 và 72 giờ) lấy mẫu di ̣ch pha loãng , nuôi cấy lên đĩa thạch môi trƣờng đặc hiệu . Ủ đĩa ở 35±20C qua đêm tùy thuộc chủng kiểm định. Đếm số khuẩn lạc vi khuẩn mọc lên ở các đĩa và xác định nồng độ vi khuẩn có mặt tại các thời điểm lấy mẫu. Mơi trƣờng lỏng không cấy VSV đƣợc sử dụng làm đối chứng [Theo 11, 13].

70

2.2.2.8. Phát hiện bacterioxin

Sau khi xác định mẫu có hoạt tính kháng khuẩn, để khẳng định là chất kháng khuẩn dạng bacterioxin có bản chất protein, tiến hành phản ứng với các enzym phân giải protein. Phƣơng pháp đƣợc tiến hành nhƣ sau [102, 103, 104, 105]: Chủng LH19 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MRS dịch thể, sau 14 giờ đem ly tâm thu dịch nổi, điều chỉnh về pH=6,5; xử lý dịch ly tâm với các enzym phân giải protein (nồng độ 0,2 mg ml-1) theo tỉ lệ 1:1. Mẫu đối chứng dƣơng (dịch nuôi cấy vi khuẩn với đệm phốt phát theo tỷ lệ (1:1) ). Các mẫu thí nghiệm đƣợc ủ ở 370C trong 2 giờ, dừng phản ứng bằng tác động nhiệt. Sau đó, thử hoạt tính bacterioxin của mẫu theo phƣơng pháp khuếch tán trên thạch. Sự nhạy cảm với enzym thể hiện qua việc mẫu bị mất hoạt tính. Các giếng mẫu không xuất hiện vịng vơ khuẩn hoặc vịng vơ khuẩn giảm nhiều so với mẫu đối chứng có nghĩa là đã xảy ra phản ứng thuỷ phân protein, làm mẫu bị mất hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả này chứng minh chất kháng khuẩn của mẫu thử nghiệm có bản chất protein (bản chất của bacterioxin).

Các enzym sử dụng trong thí nghiệm này gồm: proteinaza K pha trong đệm 20 mM Tris-HCl, pH 7,0; trypsin pha trong đệm 40 mM Tris-HCl, pH 8,2, pepxin pha trong đệm 0,002 N HCl; α-chymotrypxin pha trong 20 mM Tris-HCl, pH 8,0.

2.2.2.9. Điện di protein trên gel tricine- SDS- PAGE

Các protein có kích thƣớc nhỏ (dƣới 30 kDa) đƣợc phân tích trên hệ điện di Trixin- SDS- PAGE [107, 108]. Chuẩn bị hóa chất, dung dịch, thành phần bản gel dùng cho điện di đƣợc thể hiện trong mục 2.1.3.1.

Xử lý mẫu protein: dịch protein đƣợc bổ sung đệm xử lý mẫu và biến tính ở 100o C trong 10 phút hoặc 370C trong 30 phút với điện di tricine. Lắp bản gel, tra mẫu vào các giếng và chạy với cƣờng độ dòng cố định 10 mA trong khoảng 15 phút. Sau đó tăng cƣờng độ dòng điện lên 40 mA và tiếp tục điện di trong khoảng 45 phút. Với điện di tricine, bắt đầu chạy với hiệu điện thế 30 V cho đến khi mẫu chạy hết gel cơ, sau đó tăng lên 180 V cho đến hết bản gel. Nhẹ nhàng gỡ bản gel và nhuộm bằng Coomassie brilliant blue.

71

2.2.2.10. Xác định khả năng kháng khuẩn trực tiếp trên gel acrylamit

Hoạt tính kháng khuẩn của VSV đƣợc xác định trực tiếp trên bản gel điện di protein, sử dụng các chủng vi khuẩn kiểm định. Dịch protein thu đƣợc sau khi tiến hành phản ứng cắt bằng DTT 50 mM đƣợc điện di Tricine-SDS-PAGE thành 2 bản. Sau khi điện di, một bản đƣợc nhuộm commassie brilliant blue để đối chiếu, bản còn lại đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc loại ion vô trùng trong khoảng 2 giờ rồi đặt nhẹ nhàng lên bề mặt đĩa thạch môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn kiểm định. Tiếp đó, 5 ml mơi trƣờng thạch mềm chứa 5 x 105 tế bào vi khuẩn kiểm định đƣợc phủ lên toàn bộ bản gel. Đĩa đƣợc ủ ở 40C trong 2 giờ để hoạt chất kháng khuẩn khuếch tán vào thạch, sau đó ủ ở 30 ± 20C qua đêm. Quan sát, đối chiếu và đánh giá khả năng kháng khuẩn của mẫu [Theo 13, 107, 108].

2.2.3. Xác định hiện trạng chất thải chăn nuôi 2.2.3.1. Điều tra thực trạng chất thải chăn nuôi

- Sử dụng phƣơng pháp điều tra nhanh nông thôn theo bộ câu hỏi mở.

- Đối tƣợng điều tra là trang trại chăn nuôi lợn và gà qui mô tập trung tại Hà Nội; Nghệ An, Đắk lắc.

- Số lƣợng phiếu điều tra: 6 điểm x 5 phiếu =30 phiếu. - Xử lý thông tin theo phƣơng pháp thống kê.

2.2.3.2. Xác định khí thải H2S và NH3

Cô lập không gian lấy mẫu bởi buồng lấy mẫu, xác định khí phát thải (H2S, NH3) sau 24 giờ đặt buồng lấy mẫu [27, 33]

- Đo nồng độ H2S bằng máy chuyên dụng theo TCN 676- 2006: “Qui trình xác định khí hydrosunfua trong khơng khí chuồng ni”

- Đo nồng độ NH3 bằng máy chuyên dụng theo TCN 677- 2006: “Qui trình xác định khí amoniac trong khơng khí chuồng ni”

2.2.3.3. Xác định mật độ vi sinh vật gây bệnh, ký sinh trùng

- Xác định mật độ một số vi sinh vật gây bệnh đối với ngƣời, động vật trong chất thải chăn nuôi dạng rắn theo TCVN 4829: 2005, ISO 6579:2002/Amd.1:2007 (Phƣơng pháp phát hiện Salmonella spp. trong phân động vật và trong mẫu môi

72

trƣờng từ giai đoạn sản xuất ban đầu) và TCVN 6846: 2007, ISO 7251:2005 (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- Phƣơng pháp phát hiện Escherichia

coli giả định- Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất. Số lƣợng trứng giun đƣợc xác

định theo phƣơng pháp của Viện Sốt rét, ký sinh trùng và côn trùng TW.

2.2.3.4. Xác định hàm lƣợng các ngun tố khống, các chỉ tiêu hố tính:

N, P, Cu, Zn, Pb trong chất thải rắn đƣợc xác định theo theo TCVN 6496: 1999. Áp dụng TCVN 6168: 2002 để đánh giá khả năng chuyển hoá hợp chất các bon của vi sinh vật [33].

+ pH: Đo bằng máy pH mét

+ Phân tích nitơ tổng số (N%): Phƣơng pháp Kjeldhal, công phá bằng H2SO4 và hỗn hợp xúc tác.

+ Phân tích lân tổng số (P2O5%): Phƣơng pháp so màu, công phá mẫu bằng hỗn hợp axit H2SO4 và HClO4.

+ Phân tích cácbon tổng số (OC%): Phƣơng pháp Walkley- Black

2.2.4. Thử nghiệm và đánh giá hiệu quả của chế phẩm

2.2.4.1. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn [Theo 10, 33] dạng rắn [Theo 10, 33]

- Nguyên liệu: Chất thải chăn nuôi dạng rắn. Chế phẩm vi sinh vật, đạm, lân supe, kali sunphát, rỉ mật. Thí nghiệm đƣợc bố trí 2 cơng thức:

+ Cơng thức đối chứng: Khơng xử lý.

+ Cơng thức thí nghiệm: Chất thải chăn nuôi dạng rắn+ chế phẩm vi sinh vật. Sử dụng chất độn để điều chỉnh độ ẩm và vôi bột để điều chỉnh pH của

nguyên liệu, tiến hành ủ theo từng công thức trộn, độ ẩm nguyên liệu khi ủ khoảng 50-60%. Sau khi phối trộn xong, đánh đống ủ (mỗi đống ủ có khối lƣợng 500 kg), dùng ni lơng chịu nhiệt phủ kín đống ủ. Sau 7 ngày đảo trộn lần thứ nhất. Ngày thứ 15 đảo trộn lần hai, sau đó tiến hành ủ chín, khơng đảo trộn đến ngày thứ 21 và 30.

Các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình ủ: Nhiệt độ, biến động quần thể vi sinh vật trong đống ủ. Chỉ tiêu vật lý, hoá học đƣợc đánh giá trƣớc và sau khi ủ theo các phƣơng pháp trong 2.2.3.

73

2.2.4.2. Đánh giá độ chín và độ an tồn của phân ủ

* Phương pháp thử nghiệm cây trồng [10].

Chuẩn bị khay có kích thƣớc 38 x 28 x 6 cm, đổ đầy phân ủ, cân 10 g hạt cải, rắc đều lên bề mặt khay. Sau khi gieo, phủ một lớp ni lông lên bề mặt khay cho tới khi cây nảy mầm. Thƣờng xuyên theo dõi quá trình sinh trƣởng của cây và độ ẩm của phân ủ. Sau 7 ngày gieo, thu hoạch và cân khối lƣợng tƣơi của cây cải ở mỗi khay. Mức độ chín của đống ủ đƣợc đánh giá qua tỉ lệ nảy mầm và khối lƣợng tƣơi của mầm cải. Khối lƣợng cải trên mỗi khay 60-100 g cho biết đống ủ đã chín. Nếu khối lƣợng của cải nhỏ hơn 60 g chứng tỏ phân ủ chƣa chín do phân ủ vẫn trong q trình phân huỷ chất hữu cơ, sinh nhiệt và các độc tố, các chất hữu cơ chƣa chuyển hoá thành dạng dễ tiêu kìm hãm sự nảy mầm và quá trình phát triển của mầm cải.

* Đánh giá độ chín của nguyên liệu theo TCVN (7185: 2002)

Sử dụng nhiệt kế có thang nhiệt độ từ 00C đến 1000C, cắm sâu 50- 60 cm vào trong đơn vị bao gói có khối lƣợng khơng nhỏ hơn 10 kg. Sau 15 phút, đọc nhiệt độ lần thứ nhất. Đo, ghi chép và theo dõi sự thay đổi về nhiệt độ trong thời gian 3 ngày liên tiếp, mỗi ngày đo một lần (đo vào 9 giờ hoặc 10 giờ sáng). Phân hữu cơ bảo đảm độ chín khi nhiệt độ ổn định trong suốt thời gian theo dõi và không tăng quá 0,50C so với nhiệt độ mơi trƣờng.

2.2.4.3. Thí nghiệm đồng ruộng đánh giá hiệu quả phân bón hữu cơ

Phân bón hữu cơ đƣợc sản xuất từ nguồn chất thải chăn nuôi dạng rắn đƣợc đánh giá hiệu quả đối với cây trồng ở qui mô đồng ruộng theo 10TCN (216-2005)

Qui phạm khảo nghiệm đồng ruộng hiệu lực của phân bón đối với cây trồng. Đối

tƣợng cây trồng thử nghiệm gồm rau cải, dƣa chuột.

- Bố trí thí nghiệm theo phƣơng pháp ngẫu nhiên tồn toàn.