CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN
3.2.3.3. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải protein của chủng
Các yếu tố môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ, pH, các ion kim loại...không những ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng mà còn ảnh hƣởng tới khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính enzym phân giải protein của vi sinh vật.
* Ảnh hưởng của nhiệt độ
Để đánh giá ảnh hƣởng của các nhiệt độ khác nhau đến khả năng sinh trƣởng và hoạt tính phân giải protein, chủng B15 đƣợc nuôi lắc 48h trong môi trƣờng dịch thể ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 25 đến 550C. Xác định mật độ tế bào và hoạt tính phân giải protein thơng qua mật độ quang (OD) và hoạt độ enzym proteaza trong dịch nuôi cấy (PA).
2.3 2.8 2.6 2.1 1.7 1.4 1.2 0.74 0.97 1.02 0.83 0.52 0.26 0.32 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 25 30 35 40t(0C) 45 50 55 PA ( H P/ m l) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 O D ( 6 20 nm ) PA (HP/ml) OD (620nm)
Hình 3.20. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng và khả năng phân giải protein của chủng B15
105
Kết quả ở hình 3.20 cho thấy: ở nhiệt độ 25 và 550C, mật độ quang và hoạt tính proteaza của dịch nuôi cấy đều thấp (lần lƣợt là OD 1,2 và 1,4 và PA 0,32 và 0,26 HP/ml). Chủng B15 có khoảng nhiệt độ thích hợp tƣơng đối rộng (30- 500C), trong đó nhiệt độ 35- 450C là thích hợp nhất. Nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu cho sinh trƣởng của B15 là ở 350C (OD 2,8) còn PA đạt cao nhất ở 400C (1,02 HP mg/l).
Theo kết quả của một số nghiên cứu khác [2, 7, 29, 74] cũng cho thấy B. subtilis có khả năng tổng hợp proteaza trong khoảng 30- 500C. Kim J. M và cs [78] xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu cho vi khuẩn B. subtilis tổng hợp proteaza là 400C. Nghiên cứu của Đỗ Bích Thuỷ và cs [19, 20] lại cho thấy chủng B. subtilis có hoạt tính proteaza cao nhất khi ni ở nhiệt độ 350C. Kết quả nghiên cứu trên cho thấy khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp của chủng B15 hồn tồn phù hợp với nhiệt độ của đống ủ trong giai đoạn 2-10 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn ni.
* Ảnh hưởng của pH
Chủng B15 đƣợc nuôi lắc trong mơi trƣờng dịch thể thích hợp ở các điều kiện pH ban đầu từ 5 đến 9. Sau 48h, đo mật độ quang (OD) của dịch nuôi cấy và xác định hoạt độ enzym proteaza để đánh giá ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng và hoạt tính phân giải protein của chủng B15, kết quả thể hiện trên hình 3.21.
0.74 0.88 0.9 0.98 0.81 0.34 0.3 1.8 2.3 2.6 2.4 2 1.3 1.4 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 5 6 6.5 7 7.5 8 9 pH PA ( H P/ m l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 O D ( 6 20 nm ) PA (HP/ml) OD (620nm)
Hình 3.21. Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng và khả năng phân giải protein của chủng B15
106
Hình 3.21 cho thấy: Ở pH 5,0 và 9,0 chủng vi khuẩn B15 sinh trƣởng yêú (OD chỉ đạt 1,4 và 1,3) do đó khả năng tổng hợp proteaza cũng thấp (PA 0,3 và 0,34 HP/ml). Sinh khối đạt mức cao nhất ở pH 7,0 (OD 2,6), pH tối ƣu cho tổng hợp proteaza là 7,5 (đạt 0,98 HP/ml). Khoảng pH thích hợp cho chủng B15 sinh trƣởng và tổng hợp enzym proteaza là 6,0-8,0 hồn tồn phù hợp với q trình xử lý chất thải chăn nuôi.
Trong một số nghiên cứu khác, tác giả Kim J. M và cs [78] xác định pH ni cấy thích hợp cho vi khuẩn B. subtilis tổng hợp proteaza là từ 5 đến 6, pH tối ƣu là 7. Nghiên cứu của Đỗ Bích Thuỷ và cs [19, 20] lại cho thấy chủng B. subtilis có
hoạt tính proteaza cao nhất khi ni ở pH 8.
* Ảnh hưởng của ion kim loại
Các ion kim loại đóng một vai trị quan trọng trong việc thúc đẩy hoặc kìm hãm sinh trƣởng của vi khuẩn. Do đó, việc lựa chọn các ion kim loại bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy cũng nhƣ xử lý cơ chất trƣớc khi ủ phân cần đƣợc chú ý để tránh tác động xấu đến sinh trƣởng của vi khuẩn.
Đánh giá ảnh hƣởng của các ion kim loại hố trị hai đến hoạt tính proteaza của chủng B15 bằng phƣơng pháp sử dụng azoalbumin, chủng B15 đƣợc nuôi lắc 48 giờ trong điều kiện thích hợp, thu dịch ni cấy chứa enzym proteaza ngoại bào. Dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút thu dịch enzym thô.
Các ion kim loại đƣợc sử dụng là: Ca2+, Mg2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+ với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng bằng 10-3 M. Hỗn hợp mẫu gồm 20 l mẫu + 160 l Tris-HCl 0,05 M pH 8 + 20 l ion 10-2 M. Chuẩn bị các ống thí nghiệm: thêm 500 l cơ chất 0,2%, để 60 phút ở 370C, thêm 80 l TCA 50%. Các ống kiểm tra: thêm 80 l TCA 50% trƣớc khi cho cơ chất, ly tâm ở 10.000 v/ph
trong 5 phút, lấy dịch trong, tiếp tục lấy dịch trong + 60 l NaOH 10 N. So màu ở bƣớc sóng 450 nm, tính hoạt độ enzym. Kết quả thể hiện trong bảng 3.13.
Kết quả cho thấy, enzym ổn định hoạt tính với sự có mặt của ion Ca2+; bị giảm hoạt tính mạnh bởi Cu2+, Zn2+; ngƣợc lại, ion Ba2+, Mg2+ đồng thời làm tăng hoạt độ enzym.
107
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính proteaza chủng B15
Ion Mật độ quang (OD, 450nm) Hoạt độ tƣơng đối (%) Lần 1 Lần 2 Giá trị TB Ca2+ 0,622 0,675 0,649 95,02 Ba2+ 0,683 0,702 0,693 101,47 Mg2+ 0,682 0,704 0,693 101,54 Cu2+ 0,334 0,311 0,323 47,25 Fe2+ 0,629 0,647 0,638 93,48 Zn2+ 0,294 0,382 0,338 49,52 ĐC 0,664 0,701 0,683 100,00
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng B15 phù hợp với điều kiện sản xuất chế phẩm để xử lý chất thải chăn nuôi. Khi nhân sinh khối Ca2+ và Mg2+ đƣợc bổ sung vào mơi trƣờng ni cấy để tăng tính thẩm thấu của vách tế bào trong q trình trao đổi chất. Trong thành phần của chất thải chăn nuôi thƣờng chứa các Ca2+ , Mg2+ dƣới dạng CaO, MgO còn các nguyên tố Cu2+ , Zn2+ chỉ ởdạng vi lƣợng. Ngoài ra trong q trình xử lý chất thải chăn ni, Ca2+ cũng đƣợc bổ sung vào nguyên liệu dƣới dạng vôi bột để xử lý cơ chất, điều chỉnh pH trƣớc khi ủ.
Kết quả nghiên cứu đã xác định được chủng vi khuẩn B15 có khả năng tổng hợp proteaza ngoại bào phân giải protein trong dải nhiệt độ 30-550C; pH trung tính và kiềm nhẹ (6,0- 9,0); điều kiện thích hợp là 35- 500C, pH 6,0- 8,0. Enzym proteaza của chủng vi khuẩn B15 bị giảm hoạt tính mạnh bởi ion Cu2+, Zn2+ còn các ion Ba2+, Mg2+ và Ca2+ lại làm tăng hoặc ổn định hoạt độ enzym.