CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN
3.2.1.2. Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có độ an tồn sinh học cao [46, 58], có khả năng sinh axit lactic, đƣợc ứng dụng nhiều trong bảo quản, chế biến thực phẩm, y học, dƣợc phẩm. Trong lĩnh vực nông nghiệp, vi khuẩn lactic mới chỉ đƣợc ứng dụng nhiều trong chế biến thức ăn chăn nuôi, xử lý nƣớc nuôi trồng thủy sản, xử lý mùi hôi thối trong chuồng nuôi gia súc, gia cầm. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy vi khuẩn lactic có khả năng sinh protein kháng khuẩn dạng bacterioxin, là tác nhân chính trong phịng chống sinh học các nguồn bệnh một cách an toàn, hiệu quả [79, 87, 92, 102, 112].
Nhằm tạo chế phẩm vi sinh vật có khả năng ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh, gây thối rữa, phát thải khí độc hại khi ủ phân gia súc, gia cầm, chúng tôi đã tiến hành phân lập, tuyển chọn các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp các chất kháng khuẩn. Từ 22 mẫu đƣợc thu thập trên địa bàn thành phố Hà Nội gồm: 10 mẫu sản phẩm lên men truyền thống (nƣớc hoa quả lên men, dƣa, cà muối, thịt muối, nem chua); 4 mẫu chất thải chăn nuôi; 8 mẫu phụ phẩm chế biến thực phẩm (rỉ đƣờng, bã ép hoa quả, thức ăn chăn nuôi ủ chua...), đã phân lập đƣợc 7 chủng vi khuẩn lactic. Sau khi tách và làm thuần trên mơi trƣờng thạch đĩa MRS có bổ sung 0,5% CaCO3, vi khuẩn lactic đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể để xác định
82
khả năng sinh trƣởng và hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn gây thối Erwinia carotovora KT03. Kết quả trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả phân lập vi khuẩn lactic
Ký hiệu
chủng Khả năng tạo vòng phân giải CaCO3 Mật độ tế bào sau 48 giờ (x 108 CFU/ml) pH sau 48 giờ nuôi cấy La 02 ++ 5,4 4,2- 4,5 La 05 ++ 20,0 4,3- 4,5 La 07 + 10,4 4,3- 4,5 LH19 +++ 26,2 4,0- 4,2 LH17 +++ 62,0 3,8- 4,0 LH15 +++ 16,0 4,2- 4,3 LH11 +++ 11,6 4,0- 4,2
Để xác định yếu tố kháng khuẩn của vi khuẩn lactic là do axit lactic hay do peptid kháng khuẩn, tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch ni cấy trƣớc và sau trung hồ pH và xử lý bằng enzym proteaza. Sau khi trung hồ pH, dịch ni cấy của một số chủng vẫn có hoạt tính kháng khuẩn nhƣng khi ly tâm và xử lý bằng enzym proteaza thì lại khơng xuất hiện vịng vơ khuẩn hoặc kích thƣớc vịng vơ khuẩn giảm. Có thể vịng vơ khuẩn trƣớc khi trung hồ dịch nuôi cấy là do peptid kháng khuẩn nhƣng sau khi sử lý enzym thì protein đã bị phân huỷ. Thực tế cho thấy ở trong mơi trƣờng axit nhẹ, hoạt tính bacterioxin thể hiện mạnh hơn trong môi trƣờng kiềm nhẹ. Cho đến nay các chất kháng khuẩn nguồn gốc từ vi khuẩn lactic đều thuộc nhóm bacterioxin, do vậy dịch ni cấy thơ đƣợc dùng để xác định nhanh khả năng kháng khuẩn và sàng lọc nhanh chủng có hoạt tính sinh học cao. Sau khi phân lập, các chủng đƣợc nuôi cấy 48 giờ trên môi trƣờng dịch thể MRS, xác định khả năng sinh axit lactic và hoạt tính đối kháng E. carotovora KT03 của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc.
Tất cả 7 chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm đều có khả năng sinh axit lactic (chủng thấp nhất đạt 12,14 mg/ml đƣợc phân lập từ nem chua, chủng phân lập từ rỉ đƣờng lên men có hàm lƣợng axit lactic cao nhất, đạt 31,06 mg/ml). Mặc dù ở mức
83
độ khác nhau nhƣng dịch ni cấy vi khuẩn lactic đều có vịng ức chế đối với E. carotovora KT03, kích thƣớc vịng ức chế cao nhất đạt 22 mm; thấp nhất là 12 mm.
Tuy nhiên, khơng có mối quan hệ tỉ lệ thuận tuyệt đối giữa hàm lƣợng axit lactic với kích thƣớc vịng vơ khuẩn. Chủng vi khuẩn có hàm lƣợng axit lactic cao nhất (31,06 mg/ml) lại có vịng vơ khuẩn là 16 mm, thấp hơn so với chủng có hàm lƣợng axit lactic thấp nhất (12,14 mg/ml) với kích thƣớc vịng vơ khuẩn 17 mm. Điều đó chứng tỏ hầu hết các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp axit lactic đều có khả năng ức chế E. carotovora KT03, nhƣng khả năng đối kháng là do tác động tổng hợp, vừa của axit lactic vừa của peptit kháng khuẩn. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
Ký hiệu chủng Hàm lƣợng axit lactic (mg/ml) Đƣờng kính vịng vơ khuẩn (D-d, mm) La 02 15,05 21 La 05 13,82 16 La 07 12,14 17 LH19 27,90 22 LH17 31,06 16 LH15 22,32 17 LH11 16,10 12
Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng phân lập từ sản phẩm muối chua truyền thống (dƣa chua) ký hiệu LH19 khơng những có khả năng sinh trƣởng tốt mà cịn có kích thƣớc vịng ức chế cao nhất. Vì vậy, chủng LH19 đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Với mục tiêu bổ sung một tổ hợp các chủng vi sinh vật có chức năng khác nhau trong vai trò vi sinh vật khởi động cho q trình xử lý chất thải chăn ni nên cần thiết phải đánh giá khả năng ức chế chéo giữa các chủng. Kết quả thử nghiệm cấy vạch trên môi trƣờng thạch đĩa cho thấy 4 chủng LH19, XK112, B20 và B15 không ức chế lẫn nhau.
84
Căn cứ vào kết quả đánh giá ban đầu đã tuyển chọn đƣợc bộ chủng giống vi sinh vật cho nghiên cứu, gồm 4 chủng đƣợc trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu
Kí hiệu
chủng Đƣờng kính vịng phân giải (D-d, mm) Hàm lƣợng axit lactic (mg/ml)
Đƣờng kính vịng vơ khuẩn đối với E.
carotovora KT03
(D-d, mm) Xenluloza Tinh bột Protein
XK112 34 20 - - -
B20 26 38 - - -
B15 - 21 30 - -
LH19 27,9 22
Hình 3.2. Hoạt tính phân giải xenluloza của chủng xạ khuẩn XK112
Hình 3.3. Hoạt tính phân giải tinh bột của chủng vi khuẩn B20
Hình 3.4. Hoạt tính phân giải protein
của chủng vi khuẩn B15 Hình 3.5. Hoạt tính kháng E. carotovora KT03 của chủng vi khuẩn LH19