Khảo sát pH chiết
Tiến hành khảo sát hiệu suất chiết của hệ dung môi acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10) trong khoảng 2 đến 9, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1M và H3PO4 0,1M. Kết quả trình bày trong bảng 3.13 và hình 3.17.
Bảng 3.13: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung mơi suất chiết vào thể tích dung mơi
pH Hiệu suất chi t 2 78,6 3 86,5 4 86,6 5 85,2 6 82,1 7 68,1 9 56,6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 2 4 6 8 10 pH H (%)
Hình 3.17: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi pH của dung môi
Ofloxacin có pKa1 = 5,8; pKa2= 8,0 [31], pH của nước tiểu khoảng 5,5, trong môi trường pH < pKa1 ofloxacin tồn tại dạng phân tử khơng phân ly, khơng có tính ion, mặt khác phân tử ofloxacin khá phân cực do đó lựa chọn thực hiện chiết theo cơ chế pha đảo là hoàn toàn phù hợp. Kết quả thí nghiệm cho thấy với pH dung mơi chiết từ 3 đến 4 cho hiệu suất chiết tốt là phù hợp về khoa học. Vì vậy, chúng tơi chọn điều kiện pha hệ dung môi chiết pH = 4. Khảo sát tốc độ nạp mẫu và rửa giải
Tốc độ nạp mẫu ảnh hưởng đến sự hấp thu của chất phân tích vào pha tĩnh. Tốc độ nạp mẫu chậm thì chất hấp thu nhiều, nạp mẫu quá nhanh chất phân tích không đủ thời gian hấp thu trên cột dẫn tới hiệu suất chiết thấp. Ngoài ra cần căn cứ vào thể tích và nồng độ chất phân tích trong mẫu nạp vào cột để lựa chọn tốc độ nạp mẫu phù hợp. Theo tài liệu tham khảo [1] đối với phương pháp HPLC, cột C18 tốc độ bơm mẫu là 1,5ml/phút. Với các mẫu nước tiểu chứa ofloxacin nồng độ không quá nhỏ, thể tích mẫu nhỏ (khoảng 2,0ml), chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ nạp mẫu với cột chiết pha rắn HLB từ 0,5 đến 3,0ml/phút. Kết quả trình bày trong bảng 3.14 và hình 3.18.
Bảng 3.14: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu
Tốc độ nạp mẫu (ml/phút) Hiệu suất chiết 0,5 86,6 1,0 86,5 1,5 85,3 2,0 81,2 2,5 76,4 3,0 65,7 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 tốc độ nạp mẫu (ml/phút) Hi ệ u suất chiết (%)
Hình 3.18: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu tốc độ nạp mẫu
Kết quả phân tích cho thấy với tốc độ nạp mẫu từ 0,5 đến 1,5 ml/phút hiệu suất chiết cao (trên 85%). Khi tốc độ nạp mẫu tăng lên đến 3,0 ml/phút hiệu suất chiết chỉ cịn 65,7%. Chúng tơi chọn điều kiện nạp mẫu vào cột với tốc độ 1,0 ml/phút (thực tế trong khoảng 0,8 – 1,0 ml/phút).
Tốc độ rửa giải ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, tốc độ rửa giải nhanh thì khơng giải chiết hết, rửa giải chậm gây tốn thời gian phân tích. Trong điều kiện nghiên cứu, thể tích dung mơi rửa giải không lớn (do có sự ảnh hưởng của dung mơi khi đo mẫu) cần rửa giải với tốc độ chậm để giải chiết hết mà không bị ảnh hưởng bởi dung môi khi đo mẫu. Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ rửa giải với 3,0ml hỗn hợp dung môi với tốc độ từ 0,5 đến 3,0ml/phút. Kết quả cho thấy với tốc độ rửa giải từ 0,5 đến 2,0 ml/phút cho hiệu suất chiết tốt (85,5%), vì vậy chúng tơi chọn điều kiện tốc độ rửa giải 1,0ml/phút (tương đương tốc độ nạp mẫu).
Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải
Nghiên cứu thể tích dung mơi rửa giải thích hợp là rất cần thiết, nếu thể tích dung mơi nhỏ sẽ giảm hiệu suất chiết, thể tích dung mơi q lớn gây lãng phí và có thể ảnh hưởng đến tín hiệu đo. Chúng tơi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi là hỗn hợp acetonnitrin: metanol: đệm photphat pH 4,0 (5:85:10). Kết quả trình bày trên bảng 3.15 và hình 3.19.
Bảng 3.15: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích hiệu suất chiết vào thể tích
dung mơi V dung mơi (ml) Hiệu suất chiết 1,0 76,2 1,5 81,9 2,0 86,4 2,5 86,4 3,0 86,5 3,5 86,3 4,0 84,5 60 65 70 75 80 85 90 0 1 2 3 4 5 V dung mơi (ml) H(%)
Hình 3.19: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung mơi tích dung mơi
Kết quả phân tích cho thấy, hiệu suất chiết tăng khá nhanh khi tăng thể tích dung mơi từ 1,0 ml đến 2,0 ml, với thể tích dung mơi từ 2,5 ml đến 3,5 ml hiệu suất chiết hầu như khơng tăng thêm. Vì vậy chúng tơi chọn thể tích dung mơi chiết là 2,5ml đảm bảo hiệu suất chiết tốt và ổn định.
Kết luận về điều kiện chiết ofloxacin trong mẫu nước tiểu và xây dựng qui trình xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn:
Sau khi tiến hành khảo sát một số điều kiện thích hợp cho q trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột chiết HLB Oasis, rút ra kết luận về một số điều kiện chiết như sau:
Dung môi: acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10) Thể tích dung mơi: 2,5ml
pH 4,0
Tốc độ chảy 1,0 ml/phút
Từ các kết luận trên, chúng tơi xây dựng qui trình xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) như sau:
Qui trình: Hoạt hóa cột chiết bằng 2ml CH3OH, rửa cột bằng 5ml nước cất 2 lần. Lấy chính xác 2,50 ml nước tiểu cho đi qua cột chiết HLB với tốc độ chảy 1,0 ml/phút, rửa tạp bằng 5ml đệm photphat pH 4,0, rửa giải thu hồi ofloxacin bằng 2,5 ml hỗn hợp acetonnitrin-metanol- đệm photphat pH 4,0 (5:85:10). Lấy phần dịch chiết. Chuyển tồn bộ dịch chiết vào bình định mức 25 ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dung dịch này có thể dùng để định lượng ofloxacin bằng qui trình đã xây dựng ở mục 3.1.3.
Hình 3.20 cho thấy đường DP của ofloxacin trong mẫu nước tiểu sau xử lý theo qui trình đã xây dựng được ở trên đẹp và cân đối hơn rất nhiều so với trước khi xử lý. Điều này cho thấy: có thể áp dụng qui trình xử lý mẫu đã xây dựng được bằng phương pháp chiết pha rắn để phân tích hàm lượng ofloxacin trong nước tiểu bệnh nhân.
-1.10 -1.20 -1.30 -1.40 U (V) -150n -100n -50.0n 0 I (A )
Hình 3.20: Đường DP của dung dịch ofloxacin 4 µg/ml trong: 1) Nước tiểu trước khi xử lý; 2) Nước tiểu sau khi xử lý qua cột HLB Đánh giá phương pháp
Để đánh giá độ tin cậy của phương pháp chúng tơi tiến hành phân tích ofloxacin trong mẫu tự tạo. Mẫu tự tạo là mẫu nước tiểu của người bình thường được thêm ofloxacin ở các nồng độ khác nhau, đem xử lý và định lượng theo qui trình:
2 1
Hoạt hóa cột chiết bằng 2ml CH3OH, rửa cột bằng 5ml nước cất 2 lần. Lấy chính xác 2,50 ml nước tiểu cho đi qua cột chiết HLB với tốc độ chảy 1,0 ml/phút, rửa tạp bằng 5ml đệm photphat pH 4,0, rửa giải thu hồi ofloxacin bằng 2,5 ml hỗn hợp acetonnitrin-metanol- đệm photphat pH 4,0 (5:85:10). Lấy phần dịch chiết. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25 ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dùng pipet lấy chính xác 2,50 ml dung dịch A chuyển vào bình định mức 25,00 ml, thêm 8 ml đệm photphat pH = 6,50, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo theo điều kiện đã chọn.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.16, hình 3.21 và hình 3.22. Bảng 3.16: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu vào Ip.
TT CNT (mg/ml) Cđo (µg/ml) Ip (nA) 1 0,2 2,0 -51,5 2 0,3 3,0 -76,0 3 0,4 4,0 -95,4 4 0,5 5,0 -117 5 0,6 6,0 -145 6 0,7 7,0 -164 7 0,8 8,0 -187
Kết quả phân tích cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa Ip vào nồng độ ofloxacin.
y = 22.575x + 6.5393 R² = 0.9986 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 2 4 6 8 10 Ip (nA) C (m icrogam /ml)
Đường chuẩn ofloxacin trong NT
Hình 3.21: Sự phụ thuộc Ip và nồng độ
ofloxacin trong mẫu nước tiểu.
-1.10 -1.20 -1.30 -1.40 U (V) -200n -150n -100n -50.0n 0 I (A ) Hình 3.22: Đường AdSV của ofloxacin trong nước
tiểu (mẫu tự tạo)
Đánh giá độ đúng của phương pháp thông qua độ thu hồi. Tiến hành phân tích xác định độ thu hồi ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo có sẵn nồng độ ofloxacin bằng 0,3 mg/ml bằng phương pháp thêm chuẩn. Ofloxacin được thêm vào mẫu nước tiểu ở các nồng độ 0,24 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,36 mg/ml (tương ứng tỉ lệ thêm vào là 80%, 100% và 120%) rồi xử lý theo qui trình trên và tiến hành định lượng. Nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu được tính theo cơng thức: CNT = 0,10.CX (mg/ml), (trong đó: CNT là nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo; CX là nồng độ ofloxacin trong mẫu đo sau khi xử lý (µg/ml). Kết quả được trình bày trong bảng 3.17.
Bảng 3.17: Kết quả xác định ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo
STT
Nồng độ chuẩn thêm vào nước tiểu (mg/ml)
Nồng độ tìm lại trong dung dịch
đo (µg/ml)
Nồng độ tìm lại trong mẫu nước tiểu (mg/ml)
Re (%)
1 0,24 2,32 0,23 95,83
2 0,30 2,86 0,29 96,67
3 0,36 3,65 0,36 100,00
Như vậy, với qui trình xử lý mẫu nước tiểu như trên có thể xây dựng qui trình định lượng ofloxacin trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân bằng phương pháp von-ampe xung vi phân.
Qui trình phân tích: Lấy chính xác 2,50 ml nước tiểu cho đi qua cột chiết HLB với tốc độ chảy 1,0 ml/phút, rửa tạp chất bằng 5ml đệm photphat pH 4,0, rửa giải thu hồi ofloxacin bằng 2ml hỗn hợp acetonnitrin-metanol- đệm photphat pH 4,0 (5:85:10). Lấy phần dịch chiết. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 1). Lấy chính xác V ml dung dịch 1 chuyển vào bình định mức 25 ml, thêm 8 ml đệm photphat pH 6,50, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo theo điều kiện đã chọn.
Hàm lượng ofloxacin trong mẫu nước tiểu được xác định theo phương pháp thêm chuẩn ofloxacin vào mẫu nước tiểu rồi xử lý theo qui trình trên.
Hàm lượng ofloxacin trong mẫu nước tiểu (CNT) tính theo công thức: CNT = CX *25 25
1000 V 2,5 =
X
0, 25 * C V
Trong đó: CX là nồng độ ofloxacin trong mẫu đo (µg/ml) V: thể tích dung dịch 1 đem đo (ml)
3.1.6. Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng ofloxacin trong các mẫu nước tiểu
Áp dụng qui trình phân tích đã xây dựng trong mục 3.1.5 chúng tôi tiến hành định lượng ofloxacin trong một số mẫu nước tiểu của bệnh nhân uống ofloxacin hàm lượng 400 mg/lần (2 viên ofloxacin 200mg).
Kết quả phân tích các mẫu nước tiểu của bệnh nhân được trình bày trên bảng 3.18. Dựa vào kết quả phân tích mẫu nước tiểu của 1 bệnh nhân theo thời gian, chúng tôi thấy rằng mẫu nước tiểu thu được sau 8 giờ uống thuốc có nồng độ ofloxacin cao nhất. Để có thêm kết quả phân tích với các bệnh nhân khác nhau chúng tơi tiến hành phân tích một số mẫu nước tiểu của bệnh
nhân khác sau khi uống thuốc 8 giờ để đánh giá nồng độ đỉnh của thuốc trong nước tiểu bệnh nhân.
Bảng 3.18: Kết quả xác định hàm hàm lượng ofloxacin trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân uống 2 viên thuốc hàm lượng 200mg.
STT KHM Đặc điểm mẫu V mẫu (ml) CNT (mg/ml)
1 MS1 Sau 2 giờ uống thuốc 180 0,08
2 MS 2 Sau 4 giờ uống thuốc 145 0,14
3 MS 3 Sau 6 giờ uống thuốc 130 0,30
4 MS 4 Sau 8 giờ uống thuốc 162 0,38
5 MS 5* Sau 8 giờ uống thuốc 150 0,37
6 MS 6* Sau 8 giờ uống thuốc 165 0,37
7 MS 7* Sau 8 giờ uống thuốc 162 0,36
8 MS 8 Sau 10 giờ uống thuốc 150 0,28
9 MS 9 Sau 12 giờ uống thuốc 125 0,17
10 MS 10* Tổng nước tiểu sau 24 giờ uống thuốc
1320
0,20
*Ghi chú: Mẫu số 5,6,7,10 thuộc các bệnh nhân khác nhau
Kết quả thực nghiệm cho thấy sau khi uống liều 400mg ofloxacin, sau 2 giờ uống thuốc nồng độ thuốc trong nước tiểu khoảng 0,08mg/ml. Nồng đỉnh trong nước tiểu có thể lớn hơn 0,38 mg/ml, đạt sau khoảng 8 giờ uống thuốc. Sau 24 giờ uống thuốc lượng đào thải qua nước tiểu khoảng 265 mg (khoảng 66,3% liều sử dụng). Như vậy sự đào thải ofloxacin chủ yếu qua cầu thận dưới dạng khơng chuyển hóa.
Theo tài liệu tham khảo [3], sau khi uống liều 400mg, 75 - 80% thuốc được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng khơng chuyển hóa trong 24 đến 48 giờ, làm nồng độ thuốc cao trong nước tiểu. Như vậy, kết quả phân tích là hợp lý và có cơ sở khoa học.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 2 4 6 8 10 12 14
Thời gian (giờ)
C
(mg
/m
l)
Hình 3.23: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong nước tiểu bệnh nhân uống 2 viên ofloxacin 200mg theo thời gian
3.2. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL
Hoạt tính điện hóa của metronidazol trên điện cực giọt thủy ngân được dự đốn xảy ra q trình khử nhóm nitro thành amin:
Tiến hành khảo sát các điều kiện thích hợp để định lượng metronidazol tương tự như với ofloxacin
3.2.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp
Qua tham khảo các tài liệu và khảo sát đo trực tiếp metronidazole trong một số nền đệm thấy trong nền đệm Britton-Robinson, đệm photphat và đệm axetat pH từ 3,5 đến 5,0 có xuất hiện pic nhọn, cân đối, cường độ dịng cao, thay đổi theo nồng độ, Ep ít dịch chuyển. Chúng tơi chọn nền đệm photphat để khảo sát các điều kiện ghi đo.
+ 6e + 6H+ N N CH2 - CH2 - OH O2N CH3 N N CH2 - CH2 - OH H2N CH3 + 2 H2O
0 -200m-400m-600m-800m -1.00 U (V) -150n -100n -50.0n 0 I (A ) Hình 3.24: Đường CV của metronidazol trong nền đệm photphat 1. nền đệm photphat pH = 4,5 2. metrodinazol 0,1mg/ml -100m -200m -300m -400m U (V) -125n -100n -75.0n -50.0n -25.0n 0 25.0n I (A ) Hình 3.25: Đường DP của
metronidazol trong nền đệm photphat: 1. nền đệm photphat pH = 4,5
2. metronidazol 2,0 µg/ml Ảnh hưởng của pH dung dịch nền
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc cường độ dòng vào pH của dung dịch metronidazol 2,0 µg/ml trong nền đệm photphat pH từ 3,5 đến 6,0. Kết quả cho thấy khi pH tăng lên thế đỉnh pic dịch chuyển về phía âm hơn pic rỗng, cường độ giảm làm giảm độ chọn lọc và độ nhạy của phép phân tích. Ở pH từ 4,5 pic gọn và cân đối vì vậy chúng tơi chọn điều kiện dung dịch nền photphat pH = 4,5 cho các thí nghiệm tiếp theo.
0 -100m -200m -300m -400m -500m -120n -100n -80.0n -60.0n -40.0n -20.0n 0 I (A ) Hình 3.26: Đường DP của metronidazol trong nền đệm photphat ở các pH từ 3,5 đến 6,0 50 60 70 80 90 100 110 120 2 4 6 8 Ip (n A) pH Hình 3.27: Đồ thị Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào pH dung dịch nền
1 2 1 2 Chiều pH tăng từ 3,5 đến 6,0 pH = 4,5
Bảng 3.19: Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào pH dung dịch nền
pH 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 7,0
-Ip (nA) 97,6 98,2 106 110 101 88,5 82,1 69,7 -Ep (V) 0,176 0,185 0,233 0,261 0,286 0,320 0,398 0,435 Ảnh hưởng của biên độ xung
Để khảo sát ảnh hưởng của biên độ xung, tiến hành ghi đường DP của dung dịch metronidazol 2,0 µg/ml trong khoảng biên độ xung từ 10mV đến 100mV. Kết quả trình bày trong bảng 3.20, hình 3.28 và hình 3.29.
Bảng 3.20: Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào biên độ xung ΔEA ΔEA
(mV) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
- Ip (nA) 49,7 65,6 69,6 87,8 98,8 115 121 132 148 161
- Ep (V) 0,296 0,274 0,274 0,265 0,261 0,260 0,252 0,251 0,246 0,235 Khi tăng biên độ xung, Ip tăng, thế đỉnh pic dịch về phía dương hơn. Khi biên độ xung nhỏ pic thấp, khi biên độ xung lớn pic cao nhưng chiều rộng chân pic tăng sẽ giảm độ nhạy và độ chọn lọc. Chúng tôi chọn điều kiện đo với biên độ xung là 60 mV, cường độ dòng pic cao, ổn định và cân đối.