suất chiết vào pH của dung môi
pH Hiệu suất chiết
3 71,6 4 78,9 5 83,8 6 84,2 7 81,1 9 68,1 5,8 (pha bằng nước cất) 84,9 50 55 60 65 70 75 80 85 90 0 2 4 6 8 10 pH H (%)
Hình 3.78: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi pH của dung môi
Khảo sát tốc độ nạp mẫu và rửa giải
Như đã trình bày trong mục 3.1, tốc độ nạp mẫu ảnh hưởng đến sự hấp thu của chất phân tích vào pha tĩnh. Theo tài liệu tham khảo [1] đối với phương pháp HPLC, cột C18 tốc độ bơm mẫu là 1,5ml/phút. Với các mẫu
nước tiểu chứa cefadroxil nồng độ khơng q nhỏ, thể tích mẫu nhỏ (khoảng 2,0ml), chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ nạp mẫu với cột chiết pha rắn HLB từ 0,5 đến 3,0ml/phút. Kết quả trình bày trong bảng 3.59 và hình 3.82.
Bảng 3.59: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu
Tốc độ nạp mẫu (ml/phút) Hiệu suất chiết 0,5 83,5 1,0 83,5 1,5 82,8 2,0 79,2 2,5 74,4 3,0 63,7 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 tốc độ nạp mẫu (ml/phút) Hi ệ u suấ t c h iết (%)
Hình 3.79: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu tốc độ nạp mẫu
Kết quả phân tích cho thấy với tốc độ nạp mẫu từ 0,5 đến 1,5 ml/phút hiệu suất chiết cao (trên 83%). Khi tốc độ nạp mẫu tăng lên đến 3,0 ml/phút hiệu suất chiết chỉ còn 63,7%. Chúng tôi chọn điều kiện nạp mẫu vào cột với tốc độ 1,0 ml/phút (thực tế trong khoảng 0,8 – 1,0 ml/phút).
Tốc độ rửa giải ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, tốc độ rửa giải nhanh thì khơng giải chiết hết, rửa giải chậm gây tốn thời gian phân tích. Trong điều kiện nghiên cứu, thể tích dung mơi rửa giải khơng lớn (do có sự ảnh hưởng của dung môi khi đo mẫu) cần rửa giải với tốc độ chậm để giải chiết hết mà không bị ảnh hưởng bởi dung môi khi đo mẫu. Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ rửa giải với 3,0ml hỗn hợp dung môi với tốc độ từ 0,5 đến 3,0ml/phút. Kết quả trình cho thấy với tốc độ rửa giải từ 0,5 đến 2,0 ml/phút cho hiệu suất chiết tốt (trên 83%), vì vậy chúng tơi chọn điều kiện tốc độ rửa giải 1,0ml/phút (tương đương tốc độ nạp mẫu).
Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải
Thể tích dung môi rửa giải ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết, nếu thể tích dung mơi nhỏ sẽ chiết khơng hết chất hấp phụ, hiệu suất chiết nhỏ, tăng thể tích dung mơi có thể tăng được hiệu suất chiết nhưng thể tích dung mơi q lớn gây lãng phí và có thể ảnh hưởng đến tín hiệu đo dịng. Chúng tơi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi là hỗn hợp acetonnitrin: metanol: nước (10:80:10). Kết quả trình bày trên bảng 3.60 và hình 3.82. Kết quả phân tích cho thấy, hiệu suất chiết tăng khá nhanh khi tăng thể tích dung mơi từ 1,0 ml đến 2,5 ml, với thể tích dung mơi từ 2,5 ml đến 4,0 ml hiệu suất chiết hầu như khơng tăng. Vì vậy chúng tơi chọn thể tích dung mơi chiết là 2,5ml.
Bảng 3.60: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung mơi
V dung môi (ml) Hiệu suất chiết 1,0 66,7 1,5 78,9 2,0 82,4 2,5 83,4 3,0 83,5 3,5 83,6 4,0 83,5 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 0 1 2 3 4 5 V dung mơi (ml) H (%)
Hình 3.80: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung mơi vào thể tích dung mơi
Kết luận về điều kiện chiết pha rắn cefadroxil trong mẫu nước tiểu: Dung môi: hỗn hợp acetonnitrin-metanol-nước (10:80:10) Thể tích dung mơi: 2,5ml
pH 5 ÷ 6
Để đánh giá độ tin cậy của phương pháp chúng tơi tiến hành phân tích cefadroxil trong mẫu tự tạo. Mẫu tự tạo là mẫu nước tiểu của người bình thường (khơng uống thuốc) được thêm cefadroxil ở các nồng độ khác nhau (xem bảng 3.61) đem xử lý và định lượng theo qui trình:
Hoạt hóa cột chiết bằng 4ml CH3OH, rửa cột bằng 5ml nước cất 2 lần. Lấy chính xác 10,00 ml nước tiểu chuyển vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất định mức đến vạch (dung dịch 1). Cho 2,5 ml dung dịch 1 đi qua cột chiết HLB với tốc độ chảy 0,8 ÷ 1,0 ml/phút, rửa tạp chất bằng 5ml dung dịch đệm pH 5,0; rửa giải thu hồi cefadroxil bằng 3ml hỗn hợp acetonnitrin- metanol-nước (10:80:10). Lấy phần dịch chiết. Chuyển tồn bộ dịch chiết vào bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dùng micropipet lấy chính xác 1000 µl dung dịch A, thêm nước cất đến thể tích khoảng 5ml, thêm 4ml dung dịch NaOH 1M, thủy phân trong 45 phút ở 90oC, chuyển vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo theo điều kiện đã chọn.
Bảng 3.61: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu vào Ip.
TT CNT (mg/ml) Cđo (µg/ml) Ip (nA) 1 0,25 0,05 31,5 2 0,50 0,10 76,8 3 1,00 0,20 145 4 1,50 0,30 228 5 2,00 0,40 332 6 2,50 0,50 415
Kết quả phân tích được trình bày trong hình 3.81 và hình 3.82 cho thấy sự phụ thuộc giữa Ip vào nồng độ cefadroxil là tuyến tính.
y = 851.77x - 15.241 R² = 0.9965 0 100 200 300 400 500 DC cefadroxil trong NT Hình 3.81: Sự phụ thuộc Ip và nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu.
-500m -600m -700m -800m -900m U (V) -400n -300n -200n -100n 0 I (A ) Hình 3.82: Đường AdSV của cefadroxil trong nước
tiểu (mẫu tự tạo)
Chúng tôi tiến hành đánh giá độ đúng của phương pháp thông qua độ thu hồi. Tiến hành phân tích xác định độ thu hồi cefadroxil trong mẫu nước tiểu tự tạo có sẵn nồng độ cefadroxil bằng 0,50 mg/ml bằng phương pháp thêm chuẩn. Cefadroxil được thêm vào mẫu nước tiểu ở các nồng độ 0,4 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,6 mg/ml (tương ứng tỉ lệ thêm vào là 80%, 100% và 120%) rồi xử lý theo qui trình trên và tiến hành định lượng. Nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu được tính theo cơng thức: CNT =5.CX (mg/ml), trong đó: CNT là nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu tự tạo (mg/ml); CX là nồng độ cefadroxil trong mẫu đo sau khi xử lý (µg/ml). Kết quả được trình bày trong bảng 3.60. Kết quả cho thấy, độ thu hồi cefadroxil trong mẫu nước tiểu từ 96,88% đến 98,50% đạt yêu cầu phân tích.
Như vậy, với qui trình xử lý mẫu nước tiểu như trên có thể định lượng cefadroxil trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân.
Bảng 3.62: Kết quả xác định cefadroxil trong mẫu nước tiểu tự tạo STT
Nồng độ chuẩn thêm vào nước tiểu (mg/ml)
Nồng độ tìm lại trong dung dịch
đo (µg/ml)
Nồng độ tìm lại trong mẫu nước tiểu (mg/ml)
Re (%)
1 0,4 0,077 0,387 96,75
2 0,5 0,096 0,492 98,40
3 0,6 0,118 0,590 98,33
Áp dụng qui trình phân tích trên chúng tơi tiến hành định lượng cefadroxil trong một số mẫu nước tiểu của bệnh nhân uống cefadroxil liều 1000mg (2 viên cefadroxil 500mg) và 250mg (1 gói Tytdroxil 250mg).
Qui trình phân tích: Lấy chính xác 10,00 ml nước tiểu chuyển vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất định mức đến vạch (dung dịch 1). Cho 2,50ml dung dịch 1 đi qua cột chiết HLB với tốc độ chảy 1,0 ml/phút, rửa tạp chất bằng 5ml đệm photphat pH 5,0; rửa giải thu hồi cefadroxil bằng 3ml hỗn hợp acetonnitrin-metanol-nước (10:80:10). Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2). Dùng micropipet lấy chính xác khoảng 100µl đến 1000µl dung dịch 2 (tùy thuộc vào nồng độ cefadroxil trong nước tiểu), thêm nước cất đến thể tích khoảng 5ml, thêm 4ml dung dịch NaOH 1M, thủy phân trong 45 phút ở 90oC, chuyển vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo. Hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước tiểu được xác định theo phương pháp thêm chuẩn cefadroxil vào mẫu nước tiểu rồi xử lý theo qui trình trên. Hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước tiểu (CNT) tính theo cơng thức: CNT = CX *25 10* 25 1000 V 1 2,5 = x 2,5 * C V (mg/ml)
Trong đó: CX là nồng độ cefadroxil trong mẫu đo (µg/ml) V: thể tích dung dịch 2 đem thủy phân và đo (ml)
Kết quả phân tích hàm lượng cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân uống các liều 250mg và liều 1000mg được trình bày trên các bảng 3.63, 3.64 và được biểu diễn trên đồ thị ở hình 3.85 và hình 3.86.
Bảng 3.63: Kết quả xác định hàm hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân uống 1 gói thuốc Tytdroxil hàm lượng 250mg.
STT KHM Đặc điểm mẫu V mẫu (ml) CNT (mg/ml)
1 MS 1 Sau 1 giờ uống thuốc 120 0,37
2 MS 2* Sau 2,5 giờ uống thuốc 210 0,45
3 MS 3* Sau 2,5 giờ uống thuốc 220 0,44
4 MS 4* Sau 2,5 giờ uống thuốc 230 0,42
5 MS 5 Sau 5 giờ uống thuốc 240 0,23
6 MS 6 Sau 10 giờ uống thuốc 250 0,06
7 MS 7* Tổng nước tiểu sau 24 giờ uống thuốc
1.130
0,20
*Ghi chú: Mẫu số 2,3,4,7 thuộc các bệnh nhân khác nhau
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0 2 4 6 8 10 12
Thời gian (giờ)
C (
mg
/m
l)
Hình 3.83: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân uống 2 viên cefadroxil 250mg theo thời gian
Bảng 3.64: Kết quả xác định hàm hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân uống 2 viên thuốc hàm lượng 500mg.
STT KHM Đặc điểm mẫu V mẫu
(ml)
CNT (mg/ml) 1 MS1 Sau 1 giờ uống thuốc
90 1,61
2 MS 2 Sau 2 giờ uống thuốc 86 1,88
3 MS 3 Sau 3 giờ uống thuốc 80 2,01
4 MS 4* Sau 3 giờ uống thuốc 88 1,95
5 MS 5* Sau 3 giờ uống thuốc 92 1,98
6 MS 6 Sau 4 giờ uống thuốc
105 1,52
7 MS 7 Sau 5 giờ uống thuốc 115 1,01
8 MS 8 Sau 10 giờ uống thuốc
250 0,18
9 MS 9* Tổng nước tiểu sau 24 giờ uống thuốc
1.580
0,56
*Ghi chú: Mẫu số 4,5,9 thuộc các bệnh nhân khác nhau
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 2 4 6 8 10 12
Thời gian (giờ)
C (
mg
/ml
)
Hình 3.84: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân uống 2 viên cefadroxil 500mg theo thời gian
Kết quả phân tích mẫu nước tiểu cho thấy sau khi uống thuốc cefadroxil nồng độ cefadroxil trong nước tiểu đạt đỉnh trong khoảng 2 đến 3 giờ đầu tiên. Nồng độ đỉnh của cefadroxil trong nước tiểu có thể đạt trên 2,01mg/ml đối với liều 1000mg và 0,45 mg/ml đối với liều 250mg. Phần lớn thuốc được thải trừ sau khi uống thuốc khoảng 10 giờ. Sau khi uống thuốc 24 giờ, có đến gần 90% cefadroxil thải trừ qua đường nước tiểu. Đối chiếu với các tài liệu tham khảo, chúng tôi thấy các kết quả hợp lý về mặt khoa học.
KẾT LUẬN
Sau thời gian nghiên cứu tài liệu, tiến hành thực nghiệm, phân tích số liệu chúng tôi rút ra kết luận lần đầu tiên ở Việt Nam đã xây dựng thành cơng các qui trình phân tích kháng sinh, kháng virut, kháng histamin bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ. Các kết quả nghiên cứu cho thấy hồn tồn có thể áp dụng các phương pháp von-ampe trong kiểm nghiệm dược phẩm như một phương pháp chuẩn. Cụ thể:
1. Đã nghiên cứu tìm ra các điều kiện thích hợp nhất xây dựng qui trình phân tích ofloxacin trong dược phẩm bằng phương pháp von-ampe xung vi phân với các điều kiện cơ bản: nền đệm photphat pH = 6,5; khoảng quét thế: -1,1V÷ -1,5V;
- Giới hạn phát hiện: LOD = 5,21.10-7M; - Giới hạn định lượng: LOQ = 1,74.10-6M.
2. Đã nghiên cứu xây dựng thành cơng qui trình phân tích metronidazol trong dược phẩm bằng phương pháp von-ampe xung vi phân với các điều kiện thích hợp nhất: nền đệm photphat pH = 4,5; khoảng quét thế: 0,0V÷ -0,5V.
- Giới hạn phát hiện: LOD = 1,081.10-7M; - Giới hạn định lượng: LOQ = 3,604.10-7M.
3. Đã nghiên cứu xây dựng thành công qui trình phân tích clorpheniramin maleat trong dược phẩm bằng phương pháp von-ampe xung vi phân với các điều kiện thích hợp nhất: nền đệm photphat pH = 4,6; khoảng quét thế: - 0,8V ÷ - 1,2V.
- Giới hạn phát hiện: LOD = 3,08.10-6M; - Giới hạn định lượng: LOQ = 1,03.10-5M
4. Đã nghiên cứu tính chất hấp phụ của sản phẩm thủy phân của cefadroxil trên điện cực HMDE và xây dựng thành cơng qui trình phân tích định lượng cefadroxil trong dược phẩm bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân với các điều kiện thích hợp:
- Thủy phân trong dung dịch NaOH, nhiệt độ 90oC, thời gian 45 phút. - Điều kiện tích lũy: thế tích lũy: Eacc = -0,4V; thời gian tích lũy: 60s - Điều kiện đo: nền NaOH 0,16M; khoảng quét thế: -0,5V ÷ -0,9 V. - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp von- ampe xung vi phân: LOD = 6,22.10-8M; LOD = 2,07.10-7 M
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp von- ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân: LOD = 1,88.10-8M; LOQ = 6,28.10-8 M
5. Đã phân tích định lượng các thuốc ofloxacin; metronidazol; clorpheniramin maleat; cefadroxil trong một số chế phẩm thuốc đang lưu hành trên thị trường Hà Nội. Kết quả phân tích đáng tin cậy. Kết quả cho thấy các chế phẩm đều đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam 4 về thành phần phần trăm so với ghi trên nhãn. Các kết quả phân tích một lần nữa khẳng định hồn tồn có thể áp dụng phương pháp von-ampe với các ưu điểm nổi trội là tốc độ hồn thành nhanh, ít tốn kém, độ nhạy cao trong kiểm nghiệm dược phẩm.
6. Đã nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn (SPE) sử dụng cột chiết HLB để xử lý nước tiểu xác định ofloxacin và cefadroxil bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ với các điều kiện chiết được khảo sát:
*Xác định ofloxacin trong nước tiểu:
Hệ dung môi: acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10) pH chiết: 4,0
Độ thu hồi từ 95,37% đến 101,34%. * Xác định cefadroxil trong nước tiểu:
Hệ dung môi: hỗn hợp acetonnitrin-metanol-nước (10:80:10) pH chiết: 5 ÷ 6
Độ thu hồi từ 96,88% đến 98,50%.
7. Việc phân tích các mẫu nước tiểu bệnh nhân điều trị bằng ofloxacin và cefadroxil bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan
hấp phụ đã được áp dụng để theo dõi quá trình thanh thải của thuốc qua cầu thận. Các kết quả phân tích cho thấy thuốc được đào thải phần lớn dưới dạng khơng chuyển hóa. Các nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng các thuốc metronidazol và clorpheniramin maleat sau khi vào cơ thể đã bị chuyển hóa thành các dạng khác nhau và không thể định lượng được theo phương pháp von-ampe với các điều kiện đã xác định thuốc gốc.
Việc nghiên cứu thành công phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ định lượng thuốc trong chế phẩm và trong nước tiểu bệnh nhân cho phép mở ra hướng phát triển ứng dụng phương pháp von- ampe với ưu điểm nổi trội là tốc độ hoàn thành nhanh, giá thành rẻ trong đánh giá sinh khả dụng và thử nghiệm tương đương sinh học của thuốc ở Việt nam nâng cao tính an tồn và hiệu quả của sử dụng thuốc.
CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Trần Quang Hải, Dương Quang Phùng, Từ Vọng Nghi, (2011) “Nghiên cứu phương pháp định lượng hoạt chất trong thuốc kháng sinh
cefalexin bằng phương pháp von-ampe xung vi phân sử dụng HMDE”, Tạp
chí Hóa học, T. 49 (2ABC), Tr. 258-263, 2011.
2. Trần Quang Hải, Dương Quang Phùng, Từ Vọng Nghi, (2012), “Nghiên cứu phương pháp định lượng hoạt chất trong thuốc kháng sinh
cefaclor bằng phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ”, Tạp chí Cơng
nghiệp hóa chất, số 4/2012, tr 31-36.
3. Trần Quang Hải, Dương Quang Phùng, Từ Vọng Nghi, Hà Văn Dũng, (2012), “Nghiên cứu xác định hoạt chất cefadroxil trong thuốc kháng sinh bằng
phương pháp von - ampe xung vi phân” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Trường
Đại học Công nghiệp Hà Nội, số 9/2012, tr 34-38.
4. Trần Quang Hải, Dương Quang Phùng, Từ Vọng Nghi, (2013),