1.2.2.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng
Sâu khoang (S. litura) được xác định là sâu hại quan trọng trên các cây trồng cạn ở nước ta. Theo báo cáo kết quả chương trình cải tiến cơng tác bảo vệ thực vật ở Việt Nam (Cục BVTV, Viện BVTV và ĐH Tổng hợp, 1995) [97] cũng như kết quả điều tra của Viện BVTV, 2006), sâu khoang thường phát sinh gây hại nặng trên nhiều loại cây trồng, có thể làm giảm năng suất thu hoạch từ 7,5- 11,5% trên bắp cải, từ 5,6- 14,6% trên đậu tương cũng như nhiều loại cây trồng khác [98].
Viện Bảo vệ thực vật (2001, 2006) xác định sâu khoang là đối tượng sâu hại quan trọng trên hầu hết các cây trồng cạn trong phạm vi cả nước, thậm chí chúng có thể phát sinh thành dịch trên diện tích hàng chục hecta đậu tương tại các tỉnh như Hậu Giang, Cần Thơ, v.v., trên rau muống hoặc bắp cải trong vụ Xuân Hè tại Hà Nội, Hải Dương và một số tỉnh đồng bằng sông Hồng [4, 98].
Theo nghiên cứu của Nguyễn Duy Nhất (1970), điều kiện thích hợp cho sâu khoang phát triển ở nhiệt độ 28- 300C và độ ẩm khơng khí từ 85- 92%, độ ẩm đất 20% thích hợp cho sâu hố nhộng. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ rõ sâu khoang có tiềm năng sinh sản cao, một ngài cái có thể đẻ 2,3- 6,4 ổ trứng với tổng lượng trứng đẻ từ 123,3- 1605,0 trứng. Trên đồng ruộng, quần thể sâu khoang phát triển với mật độ cao trên bắp cải trong vụ Hè Thu và Xuân Hè từ tháng 9- 11 và từ tháng 2- 4. Điều đáng chú ý là tỷ lệ sâu non thường bị ký sinh cao trong mùa mưa nóng từ tháng 4 đến tháng 7, bệnh thối nhũn (do NPV) có thể gây chết sâu tới 33,84% vào tháng 6 hàng năm [99].
Lê Văn Trịnh (1996) xác định thời gian vòng đời sâu khoang từ 20,1- 60,6 ngày và một ngài cái đẻ từ 491,9- 668 trứng với tỷ lệ trứng nở đạt 97,6- 98,9%. Ngoài đồng ruộng, sâu phát sinh rộ từ tháng 9 đến tháng 11 hàng năm với 2 đỉnh cao mật độ quần thể. Tác giả cũng chỉ rõ các đợt mưa lớn kết hợp với sự phát sinh của NPV trong thời gian từ tháng 5 đến tháng 11 là nguyên nhân chủ yếu làm giảm mật độ sâu khoang tới 30,92% trên đồng rau Thập tự ở đồng bằng sông Hồng [100].
36
1.2.2.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại
• Kết quả điều tra NPV trên sâu hại
Nguyễn Văn Cảm và cộng sự (1996a, 1996b) đã điều tra thu thập các mẫu sâu nhiễm bệnh trên bông, đay, thuốc lá và rau màu ở nhiều tỉnh khác nhau thuộc khu vực phía Bắc và Đơng Nam Bộ, đã xác định có 5 lồi Baculovirus. Các loài Baculovirus bao gồm 4 loài NPV của sâu xanh (H. armigera), sâu khoang (S. litura) hại rau màu, sâu đo xanh (A. flava) hại đay, sâu róm hại thơng (D. punctatus) và 1 loài vi rút hạt (GV) trên sâu tơ (P. xylostella) hại rau họ Thập tự. Qua nghiên cứu NPV trên sâu xanh cho thấy vi rút NPV không chỉ gây chết đối với sâu non, mà còn gây chết hoặc ức chế khả năng hoàn thành phát dục của nhộng và trưởng thành [8, 101]. Theo nghiên cứu của Hoàng Thị Việt và Nguyễn Văn Cảm (2002), ở Việt Nam đã xác định có 10 chủng NPV trên 10 lồi sâu hại và 2 chủng GV trên 2 loài sâu hại rau là sâu tơ (P. xylostella) và sâu xanh bướm trắng (P. rapae) [102].
Trịnh Thị Xuân và cộng sự (2005), đã phân lập được bốn chủng NPV sâu keo da láng (Spodoptera exigua) gồm SeNPV – VL5, SeNPV – CT3, SeNPV – ĐT2 và SeNPV – AG1 thu tại Vĩnh Long, Cần Thơ, Đồng Tháp và An Giang. Bằng phương pháp cho ăn nhỏ giọt trên sâu tuổi 2, hiệu quả gây chết 100% sau 5 ngày lây nhiễm. Giá trị LC50 của các chủng SeNPV –VL5, SeNPV – CT3, SeNPV – ĐT2 và
SeNPV – AG1 đối với sâu keo da láng tuổi 3 lần lượt là 1,6 x 103 OBs/ml, 3,1 x 104
OBs/ml, 5,0 x 102 OBs/ml và 1,7 x 102 OBs/ml sau 5 ngày lây nhiễm [103].
• Nghiên cứu phân lập và chọn lọc chủng NPV có hoạt lực cao
Với các cơng trình nghiên cứu về NPV sâu hại đã cơng bố thì nguồn thực liệu NPV đều được thu thập từ đồng ruộng rồi đem về phịng thí nghiệm nghiền lọc tạo dịch thể. Sau đó lây nhiễm ln trên sâu nuôi hoặc sâu được thu gom ngoài đồng ruộng để sản xuất chế phẩm. Nói cách khác, việc phân lập, làm thuần và chọn lọc chủng NPV có hoạt lực cao hầu như chưa được chú ý nghiên cứu trong suốt thời gian trước năm 2002.
Theo công bố của Trần Văn Hai và cộng sự (2010), đã phân lập và làm thuần được 5 chủng NPV sâu khoang từ 5 nguồn sâu nhiễm bệnh tại Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà Vinh, An Giang và Tiền Giang. Đã xác định 2 chủng NPV thu thập tại Trà Vinh
37
và An Giang có hiệu quả diệt sâu khoang tới 94,5% sau 9 ngày nhiễm. Những nguồn thực liệu NPV đã được chọn lọc này đã được bảo quản lưu giữ tại đại học Cần Thơ để phục vụ cho các mục đích nghiên cứu lâu dài [104].
Tác giả Trần Văn Hai và cộng sự (2010) đã tiến hành thu thập sâu khoang bị lây nhiễm NPV ngoài đồng ruộng tại 5 tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Qua nghiên cứu, tác giả nhận thấy các nguồn NPV nhân từ các nguồn sâu nhiễm bệnh thu thập ngoài tự nhiên trên sâu non sâu khoang tuổi 2 đều cho tỷ lệ sâu nhiễm bệnh hình thành thể vùi đạt từ 5- 9,33 x 108 OB/ml trong điều kiện phịng thí nghiệm. Thí nghiệm so sánh các nguồn NPV thu thập được với hàm lượng 10,8 x 108 OB/ml thì hiệu lực gây chết trên sâu non sâu khoang tuổi 2 từ 72,5- 94,5%, song với mức độ rất khác nhau giữa các nguồn NPV thu thập được từ các vùng sản xuất nông nghiệp khác nhau [104]. Kết quả công bố của Trịnh Thị Xuân và cộng sự (2016), chủng NPV sâu xanh (Helicoverpa armigera) thu từ Cần thơ có hiệu lực gây chết cao, đạt từ 67,7- 85,2% tuỳ theo từng các giai đoạn phát dục của sâu [103].
1.2.2.3. Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào và áp dụng trong thực tiễn chưa nhiều. Các lĩnh vực đã áp dụng thành công công nghệ nuôi nhân tế bào động vật mới chỉ tập trung trong ngành y tế và thú y để sản xuất vắc xin phịng chống dịch bệnh. Ni nhân tế bào phôi của một số giống gia súc và cá trong chăn ni và thủy sản để duy trì nguồn gen bản địa và kiểm định dịch bệnh.
Trong trồng trọt cũng đã bước đầu nghiên cứu nuôi nhân bao phấn phục vụ lai tạo giống. Riêng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật, việc nuôi nhân phát triển sinh khối tế bào côn trùng phục vụ sản xuất chế phẩm vi rút phòng trừ sâu hại còn rất mới mẻ, trong khi việc phát triển sinh khối NPV sâu hại theo phương thức truyền thống đã kết thúc do gặp nhiều hạn chế khó khắc phục (như trình bày ở phần sau).
Theo Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2010), huyết thanh là nhân tố cung cấp các chất dinh dưỡng tăng trưởng cần thiết cho chức năng tế bào, huyết thanh còn hoạt động như một chất đệm pH, làm bất hoạt các chất độc góp phần làm tăng khả năng ổn định của sinh trưởng tế bào trong quá trình nhân sinh khối tế bào. Huyết thanh còn cung cấp hormon và chứa các protein bám giúp vận chuyển các
38
hormone, chất dinh dưỡng và tế bào chống tác hại của các chất thải trong quá trình nhân ni. Ngồi ra, huyết thanh cịn chứa các nhân tố biệt hoá và chất ức chế men Protease phân huỷ tế bào [72]. Vì vậy, việc nhân sinh khối tế bào không thể thiếu việc lựa chọn và sử dụng huyết thanh cho môi trường nuôi nhân.
Để hướng tới việc phát triển sinh khối tế bào phục vụ lây nhiễm NPV tạo chế phẩm sinh học, từ năm 2011 Lê Văn Trịnh và Lê Thanh Hải Hà đã bước đầu nghiên cứu và đã tạo được dòng tế bào từ mơ phơi và mơ mỡ. Trong đó, dịng tế bào mơ phơi có nhiều tiềm năng, qua nhân ni sơ cấp, dịng tế bào từ mô phôi đã đạt mật độ 2,9 x 108 tế bào/ml ở chu kỳ nuôi nhân lần đầu và đạt 2,57 x 1010 tế bào/ml ở chu kỳ 3, còn với dịng tế bào từ mơ mỡ đạt tương ứng là 1,62 x 108 và 1,71 x 1010 tế bào/ml. Trong nhân nuôi thứ cấp ở chu kỳ 9, dịng tế bào từ mơ phơi đã đạt 3,03 x 1010 tế bào/ml và dịng tế bào từ mơ mỡ đạt 2,17 x 1010 tế bào/ml. Các tác giả đã xác định dòng tế bào này có tiềm năng phát triển cao và ổn định, có thể lây nhiễm để phát triển sinh khối NPV. Hiện tại, 2 dịng tế bào từ mơ phơi và mơ mỡ đã được duy trì bảo quản trong bộ sưu tập quĩ gen vi sinh vật tại Viện Bảo vệ thực vật và đã đăng ký bản quyền sở hữu trí tuệ để phục vụ cho nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng và phát triển chế phẩm sinh học sau này [105].
1.2.2.4. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV
Trong những năm 1990- 2002, việc lây nhiễm NPV được tiến hành trên sâu non bằng cách nghiền sâu chết bệnh thu ngoài đồng rồi pha với nước cất, cứ 1 sâu pha với 10- 60ml nước rồi lây nhiễm trên sâu khỏe qua con đường thức ăn nuôi sâu, kết quả cho tỷ lệ chết từ 72- 100% (Nguyễn Văn Cảm và cộng sự 1996a) [8].
Việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV sâu hại ở nước ta tập trung từ năm 1985 đến năm 2005 do 2 cơ quan là Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Bông Nha Hố (nay là Viện Nghiên cứu Bông và phát triển nông nghiệp Nha hố) tiến hành.
Tại Viện Bảo vệ thực vật, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV được khởi xướng từ năm 1996 với sự giúp đỡ của các chun gia Liên Xơ (cũ). Sau đó, được tiến hành theo chương trình CNSH qua 2 đề tài cấp Nhà nước kế tiếp nhau từ năm 1996 đến năm 2005 và 01 dự án giai đoạn 1990- 1995. Các đề tài, dự án đã thu được nhiều thành tựu to lớn và có giá trị thực tiễn cao đối với cơng tác bảo vệ thực
39
vật ở Việt Nam. Tổng hợp đến năm 2005, đã đạt được kết quả cụ thể sau:
- Đã nghiên cứu, xây dựng được qui trình sản xuất thức ăn nhân tạo nuôi sâu. Đã thiết lập được 01 pilot và tổ chức nhân nuôi được số lượng đáng kể sâu non của loài sâu xanh và sâu đo xanh phục vụ lây nhiễm vi rút để sản xuất chế phẩm NPV. - Xây dựng được qui trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm NPV từ nguồn sâu non nhân nuôi. Đã nghiên cứu kỹ thuật tạo dạng sử dụng chế phẩm dưới dạng bột thấm nước. Phối hợp với chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) tạo sản phẩm phổ rộng (ký hiệu VBt) để phòng trừ sâu hại [97, 98].
Cũng trong các năm 2000-2005 tại Trung tâm bông Nha Hố, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV sâu xanh cũng được tiến hành khá mạnh mẽ theo phương pháp nuôi sâu kết hợp với thu thập nguồn sâu trên đồng ruộng. Sau đó đem về phịng thí nghiệm lây nhiễm vi rút và nghiền lọc lấy dịch thể chứa virus để sử dụng. Trung tâm đã sản xuất được từ 50- 100 lít/năm chế phẩm NPV dạng thơ để phòng trừ loại sâu khoang và sâu xanh hại bông (Nguyễn Thị Hai, 2005) [106].
Tại Viện Bảo vệ thực vật, việc sản xuất chế phẩm NPV đề phòng trừ sâu đo xanh hại đay cách và sâu róm hại thông bằng 2 cách: Cách 1 là nuôi sâu non đến tuổi 3- 4 thì nhiễm NPV, sau đó thu hồi sâu chết, nghiền lọc lấy dịch đem sử dụng hoặc tạo dạng chế phẩm khô; Cách 2: thu sâu non ngoài đồng về nhiễm vi rút, rồi nghiền lọc và đem sử dụng (Nguyễn Văn Cảm và cộng sự, 1996b; Trương Thanh Giản và cộng sự, 1996, Hoàng Thị Việt và cộng sự, 2002) [101, 107, 102].
Tuy nhiên, vào các năm sau đó thì cả 2 đơn vị này khơng sản xuất chế phẩm NPV tại chỗ, mà chuyển giao hướng dẫn kỹ thuật cho nông dân cách thu thập sâu non sâu khoang, sâu xanh bị nhiễm bệnh ngồi đồng ruộng. Sau đó, đem về nhà nghiền lọc, rồi đem sử dụng để phòng trừ các sâu này trên ruộng của chính mình. Hoạt động đó đã góp phần nâng cao đáng kể nhận thức và kỹ thuật cho nông dân trong việc sử dụng nguồn lợi vi rút tự nhiên để phòng chống sâu hại.
Từ kết quả nghiên cứu và sản xuất chế phẩm NPV sâu khoang và sâu xanh của 2 cơ quan nói trên. Nhận thấy để có thể sản xuất chế phẩm qui mơ lớn theo phương pháp nuôi sâu cần phải giải quyết một số vấn đề sau:
40
sâu và hệ thống xử lý vô trùng sâu non trước khi nhiễm vi rút với các trang thiết bị đồng bộ.
2/ Phải thiết lập hệ thống dây chuyền chuyên sản xuất thức ăn nuôi sâu số lượng lớn và đảm bảo không bị tạp nhiễm.
3/ Có hệ thống phịng, thiết bị biệt lập phục vụ việc lây nhiễm vi rút NPV. 4/ Phải có hệ thống phịng và hệ thống thiết bị tạo dạng chế phẩm và kiểm định chất lượng chế phẩm.
Mặt khác, thực tế sản xuất chế phẩm đã gặp phải 2 cản trở lớn nhất về công nghệ. Trước hết là khả năng nuôi sâu số lượng lớn không thể đạt tỷ suất nhân như mong muốn và không thể chủ động, do tỷ lệ sâu chết bệnh cao và sức sống của sâu qua các đợt nuôi ngày càng kém. Đồng thời, chất lượng thức ăn sản xuất ra không đáp ứng ổn định cho việc nhân nuôi sâu non.
Những khó khăn phát triển sản xuất chế phẩm NPV với qui mơ cơng nghiệp như đã nói trên ở Việt Nam cũng hoàn toàn giống như các nước khác trên thế giới. Theo tổng kết của Grzywacz et al. (1996), việc nhân sinh khối vi rút bằng con
đường nhiễm NPV trên sâu non ở Ấn Độ có 3 vấn đề cản trở là: 1/ Khả năng sinh sản của sâu giảm nhanh qua thời gian nuôi; 2/ Các dụng cụ, thiết bị nhân nuôi sâu bị nhiễm vi sinh vật hại và vi sinh vật cạnh tranh với NPV làm chất lượng chế phẩm kém; 3/ Không thể cung cấp lượng lớn sâu non đồng đều, có chất lượng [12].
Các tác giả cũng cho rằng có nhiều ngun nhân khơng thể sản xuất chế phẩm NPV có chất lượng ổn định với qui mơ cơng nghiệp, có 6 ngun nhân quan trọng nhất khơng thể phát triển, đó là: 1/ Chất lượng sâu nuôi kém; 2/ Thực liệu NPV để lây nhiễm không đảm bảo; 3/ Liều lượng NPV lây nhiễm khơng thích hợp do kích thước sâu khơng đều; 4/ Kỹ thuật ni sâu rất khó cải tiến; 5/ Thu hồi sản phẩm khơng đúng lúc do sâu non phát triển không đồng đều; 6/ Vệ sinh vô trùng phịng ni nhân sâu rất khó khăn [12, 97, 98].
Với kết quả nghiên cứu thu được, các nhà nghiên cứu về bảo vệ thực vật ở Việt Nam cũng đều khẳng định vi rút nhân đa diện (NPV) là tác nhân gây bệnh khá phổ biến và có hiệu quả phịng trừ các lồi sâu hại ngoài đồng ruộng (Viện Bảo vệ thực vật, 2006) [98]. Tuy nhiên, những nghiên cứu chuyên sâu về NPV cũng như
41
nghiên cứu phát triển sinh khối tạo sản phẩm để phòng chống sâu hại còn rất ít.
1.2.2.5. Nghiên cứu tạo dạng và sử dụng chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại
Nguyễn Văn Cảm et al. (1996a) đã nghiên cứu tạo dạng chế phẩm theo công nghệ nuôi sâu hàng loạt, rồi tiến hành nhiễm NPV trên sâu non. Sau đó, thu hồi các cá thể sâu chết để tạo chế phẩm phòng trừ sâu hại. Việc tạo dạng sử dụng chế phẩm bằng cách lây nhiễm trên sâu non được tiến hành bằng 2 cách:
+ Dạng dịch thể: Bằng cách nghiền nguồn vật liệu sâu chết bệnh rồi pha nước thành dạng dịch thể, sau đó lọc bỏ xác sâu, bổ sung hóa chất chống thối. Sau đó, đóng chai và chuyển đến nơi sử dụng. Sản phẩm được đem sử dụng trực tiếp trên đồng ruộng với liều lượng 500 sâu chết bệnh để phun cho 1 ha.