Tìm hiểu khả năng ni nhân tế bào sâu khoang khối lượng lớn làm cơ sở hướng tới phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại cây trồng, đề tài đã tiến hành nuôi nhân tế bào với lượng môi trường 150ml và 750ml, theo phương pháp tĩnh và phương pháp lắc ở điều kiện thích hợp với hàm lượng tế bào ban đầu đưa vào nuôi nhân là 0,5 x 1010 tế bào/ml.
• Nhân sinh khối tế bào theo phương pháp tĩnh và lắc trên bình 250ml
Tiến hành thử nghiệm nhân nuôi tế bào sâu khoang với lượng 150ml trên bình lọc khuẩn 250ml theo 2 phương pháp: dạng tĩnh và dạng lắc với mật độ tế bào ban đầu là 0,5 x 1010 tế bào/ml trên mơi trường Excell 420-14419C có bổ sung 25% FBS, ở nhiệt độ 280C và pH= 6,8, riêng với công thức lắc tiến hành trên máy lắc tốc độ 50 vòng/phút liên tục 24 giờ.
Kết quả đánh giá qua 6 lần thí nghiệm nhân sinh khối hàm lượng tế bào và hệ số nhân mật độ tế bào trong sinh khối vào 6 ngày sau nuôi nhân (Bảng 3.12) cho thấy:
Khi nuôi nhân tế bào theo phương pháp tĩnh, mật độ tế bào trong sinh khối đạt từ 3,17 – 3,445 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân số lượng tế bào trong sinh khối tăng từ 6,26- 6,89 lần so với mật độ tế bào ban đầu khi đưa vào nuôi nhân. Mật độ tế bào trung bình đạt 3,247 x 1010 tế bào/ml, chỉ tăng được 6,49 lần so với mật độ tế bào trước khi đưa vào nhân sinh khối. Trong 6 đợt thí nghiệm, lần 1 cho mật độ tế bào cao nhất tới 3,445 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân sinh khối tế bào đạt 6,89 lần và lần thí nghiệm 4
90
chỉ đạt mật độ 3,17 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân đạt 6,34 lần so với mật độ tế bào ban đầu đưa vào nhân sinh khối (Bảng 3.12).
Bảng 3.12. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân theo phương pháp tĩnh và lắc trên bình lọc khuẩn 250ml
Lần thí nghiệm Mật độ ban đầu (x 1010 tb/ml) Phương pháp tĩnh Phương pháp lắc Mật độ tế bào (x 1010 tb/ml) HS nhân (lần) Mật độ tế bào (x 1010 tb/ml) HS nhân (lần) 1 0,5 3,445 c 6,89 4,580 b 9,16 2 0,5 3,337 b 6,67 4,780 ab 9,56 3 0,5 3,129 a 6,26 4,590 a 9,18 4 0,5 3,170 a 6,34 4,595 b 9,19 5 0,5 3,270 ab 6,54 4,587 b 9,17 6 0,5 3,133 a 6,27 4,879 c 9,76 TB 0,5 3,247 6,49 4,752 9,50 CV (%) 3,192 - 6,219 - LSD0,05 0,616 - 0,494 -
Ghi chú: tb: Tế bào; HS: Hệ số nhân; TB: Mật độ tế bào trung bình; Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05
Khi nuôi nhân phát triển sinh khối tế bào theo phương pháp lắc với tốc độ 50 vòng/phút liên tục 24 giờ, mật độ tế bào đạt từ 4,58- 4,879 x 1010 tế bào/ml và hệ số nhân số lượng tế bào đạt từ 9,16- 9,76 lần so với mật độ tế bào ban đầu. Trung bình cả 6 lần thí nghiệm, mật độ tế bào đạt 4,752 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân sinh khối tế bào đạt được là 9,50 lần (Bảng 3.12).
Như vậy, nuôi nhân tế bào theo phương pháp lắc cho hiệu quả tăng mật độ tế bào cao hơn so với phương pháp tĩnh trung bình 3,01 lần so với mật độ ban đầu.
Kết quả xử lý thống kê so sánh mật độ tế bào hình thành trong cùng một phương pháp nhân ni thì mật độ tế bào và hệ số nhân cũng có sự khác nhau một cách có ý nghĩa với độ tin cậy P ≤ 0,05, mặc dù giá trị thực tế sai khác nhau không lớn giữa các đợt thí nghiệm.
91
Hình 3.9: Nhân tế bào theo phương pháp lắc (A) và theo phương pháp tĩnh (B)
• Khả năng phát triển sinh khối của tế bào sâu khoang theo phương pháp tĩnh và lắc trên bình 1 lít
Nhằm hướng tới ni nhân tế bào với sinh khối lớn, một thử nghiệm đã được tiến hành với lượng 750ml mơi trường trên bình lọc khuẩn Erlemeeyer Flask dung tích 1,0 lít với mơi trường Excell 420-14419C và 2 loại môi trường rẻ tiền hơn (bằng 60- 70% giá mua Excell 420-14419C) là Schneider S9895 và Grace.
Kết quả (Bảng 3.13) thí nghiệm cho thấy khi nhân sinh khối tế bào trên môi trường Excell 420-14419C theo phương pháp lắc 50 vòng/phút liên tục 24 giờ, sau 2 ngày nuôi nhân mật độ tế bào đạt 2,68 x 1010 tế bào/ml, còn theo phương pháp tĩnh đạt 2,42 x 1010 tế bào/ml. Sau 6 ngày, tương ứng với 2 phương pháp (tĩnh và lắc) mật độ tế bào đạt cao nhất tới 3,14 và 4,08 x 1010 tế bào/ml. Sau 10 ngày nuôi nhân, với phương pháp tĩnh và lắc đạt mật độ 2,69 và 3,45 x 1010 tế bào/ml (tương ứng) và đến 14 ngày sau nuôi nhân đạt 1,93 và 2,61 x 1010 tế bào/ml (tương ứng).
Khi sử dụng môi trường Schneider S9895 và Grace theo phương pháp lắc, mật độ tế bào cũng đều cao hơn hẳn so với phương pháp tĩnh. Trong 2 ngày đầu sau khi nuôi nhân theo phương pháp lắc, mật độ tế bào đạt 1,89 x 1010 tế bào/ml với môi trường Schneider S9895, đạt 1,82 x 1010 tế bào/ml với môi trường Grace. Nhưng thực hiện theo phương pháp tĩnh, mật độ tế bào trên 2 môi trường này chỉ đạt tương ứng là 1,8 và 1,62 x 1010 tế bào/ml.
Tại thời điểm 6 ngày sau nuôi nhân, ở công thức nuôi nhân theo phương pháp lắc với môi trường Excell 420-14419C đạt tới 4,08 x 1010 tế bào/ml, cịn với mơi
92
trường Schneider S9895 đạt 2,97 x 1010 tế bào/ml, và với môi trường Grace đạt 2,37 x 1010 tế bào/ml. Trong khi ở công thức nuôi nhân theo phương pháp tĩnh, tương ứng với 3 loại môi trường Excell 420-14419C, Schneider S9895 và Grace chỉ đạt tương ứng 3,14, 2,62 và 2,15 x 1010 tế bào/ml.
Đến thời điểm 10 ngày sau ni nhân thì sinh khối tế bào chỉ tăng ở công thức nuôi nhân theo phương pháp lắc với môi trường Excell 420-14419C và đạt tới 3,45 x 1010 tế bào/ml, cịn ở cơng thức nuôi nhân theo phương pháp tĩnh với cùng loại môi trường mật độ tế bào hình thành chỉ đạt 2,69 x 1010 tế bào/ml. Trong khi đó, ni nhân tế bào với môi trường Schneider S9895 và Grace theo phương pháp lắc đạt 2,04 và 1,75 x 1010 tế bào/ml (tương ứng), còn theo phương pháp tĩnh mật độ tế bào giảm nhanh, chỉ còn 1,20 và 1,16 x 1010 tế bào/ml (tương ứng).
Bảng 3.13. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân với lượng 750ml mơi trường trên bình lọc khuẩn 1000ml
theo phương pháp tĩnh và lắc
TT Cơng thức
thí nghiệm
Mật độ tế bào ở các ngày sau nuôi nhân (x1010 tế bào/ml)
2 ngày 6 ngày 10 ngày 14 ngày
1 Tĩnh (Excell 420-14419C) 2,42 b 3,14 b 2,69 b 1,93 b Lắc (Excell 420-14419C) 2,68 a 4,08 a 3,45 a 2,61 a 2 Tĩnh (Schneider S9895) 1,80 c 2,62 c 1,20 e 1,13 e Lắc (Schneider S9895) 1,89 bc 2,97 b 2,04 c 1,23 d 3 Tĩnh (Grace) 1,62 a 2,15 d 1,16 e 1,09 e Lắc (Grace) 1,82 c 2,37 cd 1,75 d 1,41 c CV (%) 1,092 1,497 1,645 0,192 LSD0,05 0,519 0,646 0,758 0,616
Ghi chú: NSNN; Ngày sau nuôi nhân; Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05
Khi kéo dài thời gian nuôi nhân tế bào tới 14 ngày, mật độ tế bào ở tất cả các công thức đều giảm đáng kể cả khi nuôi nhân theo phương pháp lắc, tương ứng với với 3 môi trường mật độ tế bào chỉ đạt 2,61, 1,23 và 1,41 x 1010 tế bào/ml. Trong số đó, sử
93
dụng môi trường Excell 420-14419C mật độ tế bào có giảm nhưng vẫn cịn tới 2,61 x 1010 tế bào/ml. Còn áp dụng theo phương pháp tĩnh, mật độ tế bào chỉ đạt 1,93, 1,13 và 1,09 x 1010 tế bào/ml tương ứng với các môi trường Excell 420-14419C, Schneider S9895 và môi trường Grace.
Như vậy, để nhân sinh khối tế bào sâu khoang với lượng 150ml hoặc 750ml có hiệu quả cao, việc nuôi nhân theo phương pháp lắc liên tục trong 24 giờ là rất cần thiết và nên thu hoạch sinh khối sau 6 ngày ni nhân. Có thể do lắc liên tục đã tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cung cấp oxy cho sinh khối tế bào phát triển.
Kết quả nghiên cứu từ các thí nghiệm nói trên cho phép xác định để phát triển sinh khối tế bào sâu khoang có hiệu quả, các yếu tố cần thiết đã được xác định cụ thể như sau:
- Điều kiện thích hợp để phát triển sinh khối tế bào sâu khoang trên môi trường Ex-Cell 420-14491C có bổ sung 25% FBS ở pH = 6,8 và nhiệt độ 280C. Khi nhân ni tế bào ở điều kiện thích hợp hàm lượng tế bào có thể đạt từ 4,025- 5,750 x 1010 tế bào/ml vào 6 ngày sau nuôi nhân.
- Nuôi nhân tế bào theo phương pháp lắc liên tục 24 giờ tốc độ 50 vòng/phút cho hiệu quả hơn hẳn so với nuôi nhân ở trạng thái tĩnh, mật độ tế bào 1,33- 1,56 lần (trung bình cao hơn từ 3,01 lần) với lượng 150ml mơi trường trên bình 250ml và 1,1- 1,3 lần (trung bình 1,18 lần) với lượng 750ml trên bình 1 lít. Điều đó chứng tỏ hồn tồn có khả năng ni nhân tế bào sâu khoang ở qui mơ phịng thí nghiệm trên bình cổ vếch lọc khuẩn 250ml hoặc bình Erlemeeyer Flask dung tích 1000ml.