lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân
+ Nuôi nhân nguồn thực liệu tế bào để tiến hành các thí nghiệm: Nguồn thực
liệu tế bào sâu khoang là dòng tế bào phát triển từ tế bào gốc của mô tiền phôi của nhộng sâu khoang từ năm 2011, đã được phân lập nuôi nhân, chọn lọc qua 135 chu kỳ, hiện đang được lưu giữ trong các lọ lưu trữ 2ml và được bảo quản ở điều kiện lạnh sâu ở nhiệt độ -1980C tại Viện Bảo vệ thực vật. Trước khi thực hiện nhân nguồn thực liệu tế bào cho các thí nghiệm, lấy 3 lọ và tiến hành cơng đoạn phục hồi nguồn thực liệu tế bào theo phương pháp của Lynn (2002) [30], bằng cách đặt lọ tế bào bảo quản vào cốc nước ấm 370C trong thời gian 2 phút. Sau đó, lấy ra khỏi cốc nước ấm vơ trùng và nhanh chóng lau khơ bên ngồi lọ tế bào bằng cồn 70%, mở nắp dùng micropippete hút 1,0ml thực liệu tế bào cho vào bình cổ vếch có nắp lọc khuẩn dung tích 25cm2 có chứa 4,0 ml mơi trường Ex-cell 420- 14419C đã chuẩn bị sẵn và bọc xung quanh miệng bình bằng giấy parafilm. Rồi chuyển vào tủ nuôi nhân ở nhiệt độ 280C cho tế bào phát triển bám vào đáy bình trong 30 - 45 phút.
Sau khi hình thành lớp tế bào bám dính ở đáy bình, nhẹ nhàng hút bỏ hết môi trường cũ, các mảng tế bào chết và những tế bào khơng khỏe mạnh khơng bám dính được. Sau đó, bổ sung 4,0ml mơi trường Ex-cell 420- 14419C mới và đưa vào tủ ni nhân có nhiệt độ 280C. Cứ sau 24 giờ, tiếp tục loại bỏ môi trường cũ, thay môi trường mới và lặp lại 3- 4 lần cho đến khi lớp tế bào bám dính đồng nhất hình thành ở đáy bình ni nhân.
Do tế bào sâu khoang thuộc nhóm tế bào bám dính lỏng lẻo, khơng chặt nên dễ dàng tạo dịch tế bào dạng huyền phù bằng phương pháp Trypsin hóa theo phương pháp của Lynn (2002) [30]. Đến lần nuôi nhân cuối cùng sau 3- 4 lần nuôi nhân trong bình cổ vếch 25cm2, tiến hành loại bỏ môi trường nuôi nhân cũ và bổ sung 2ml chất đệm Trypsin-EDTA 0,25%. Đặt các bình tế bào vào buồng cấy vơ trùng ở nhiệt độ trong phịng, sau 5 phút tiến hành hút hết dung dịch Trypsin-EDTA và để bình ni trong buồng cấy thêm 5 phút. Sau đó, cho 4ml mơi trường mới và lắc với tốc độ 50 vòng/phút trong 2 phút để tạo dịch tế bào dạng huyền phù, rồi
50
chuyển sang nuôi nhân khối lượng lớn trong bình cổ vếch có nắp lọc khuẩn loại 250cm2 chứa sẵn 150ml môi trường Ex-cell 420- 14419C ở nhiệt độ 28 ± 0,50C.
Tiếp tục ni nhân trong 6 ngày, sau đó thu dịch tế bào dạng huyền phù vào các ống ly tâm 50ml và ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, gạn bỏ dịch môi trường cũ, cho vào mỗi ống ly tâm 5ml môi trường Ex-cell 420- 14419C mới và dùng micropipet hút đẩy nhẹ nhàng để các tế bào phân bố đồng đều trong môi trường rồi chuyển vào các bình ni cấy cổ vếch loại 250cm2 mới có chứa sẵn 150ml mơi trường và đặt trong tủ nuôi nhân tế bào ở nhiệt độ 28 ± 0,50C. Sau 3 ngày tiến hành lắc nhẹ với tốc độ 50 vòng/phút và tiếp tục đặt vào tủ nuôi nhân, đến ngày thứ 6 hàm lượng tế bào có thể đạt tới 0,5 x 1010 tế bào/ml và sẵn sàng để sử dụng cho yêu cầu của các thí nghiệm tiếp theo.
2.4.2. 1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang
• Xác định mơi trường thích hợp trong ni nhân tế bào sâu khoang
Được thực hiện theo phương pháp của Lynn và Shapiro (1998) [67], thí nghiệm tiến hành trên khay 12 giếng với 5 công thức là môi trường nhân sinh khối không bổ sung 15% FBS và điều chỉnh pH là 6,8. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần trong điều kiện nhiệt độ 28 ± 0,50C với hàm lượng tế bào ban đầu là 0,5 x 1010 tế bào/ml. Trước và sau 2, 6 và 10 ngày nhân nuôi, lấy mẫu đếm trên buồng đếm hồng cầu và tính số lượng tế bào có trong 1ml dịch ni.
Cơng thức 1: Môi trường Excell 420- 14419C Công thức 2: Môi trường Schneider S9895 Công thức 3: Môi trường TNM-FH T3285 Cơng thức 4: Mơi trường TC-100 T3160
• Điều kiện nhiệt độ thích hợp để ni nhân tế bào sâu khoang
Tiến hành thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình phát triển sinh khối tế bào được tiến hành theo qui trình hướng dẫn của Invitrogen Life Technologies (2002) [50]. Thí nghiệm được tiến hành trên bình cổ vếch nắp lọc khuẩn 25cm2 với 4 công thức nhiệt độ khác nhau, mỗi công thức nhắc lại 3 lần trên mơi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 20% FBS và pH= 6,8 với mật độ tế bào ban đầu là 0,5 x 1010 tế bào/ml.
51 Công thức 1: Nhiệt độ nuôi cấy 24 ± 0,50C Công thức 2: Nhiệt độ nuôi cấy 26 ± 0,50C Công thức 3: Nhiệt độ nuôi cấy 28 ± 0,50C Công thức 4: Nhiệt độ nuôi cấy 29 ± 0,50C
Trước và sau 2, 4, 6 và 8 ngày nhân nuôi, lấy mẫu đếm số lượng tế bào hình thành có trong 1ml dịch ni trên buồng đếm hồng cầu.
• Điều kiện pH mơi trường thích hợp ni nhân tế bào sâu khoang
Theo qui trình hướng dẫn của Invitrogen Life Technologies (2002) [50]. Thí nghiệm được tiến hành trên bình cổ vếch nắp lọc khuẩn 25 cm2 với môi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 20% FBS ở nhiệt độ 29 ± 0,50C với hàm lượng tế bào 0,5 x 1010 tế bào/ml. Tiến hành với 6 công thức là các mức pH khác nhau, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại gồm 3 bình ni nhân. Cụ thể như sau:
Cơng thức 1: pH = 6.0 Công thức 2: pH = 6.2 Công thức 3: pH = 6.4 Công thức 4: pH = 6.6 Công thức 5: pH = 6.8 Công thức 6: pH = 7.0
Trước và sau 2, 4, 6 và 8 ngày nhân ni thì lấy mẫu đếm số lượng tế bào hình thành có trong 1ml dịch ni trên buồng đếm hồng cầu.
• Xác định tỷ lệ FBS thích hợp nhân ni tế bào sâu khoang
Thí nghiệm cũng được tiến hành theo phương pháp của Lynn (2002) [30] trên bình cổ vếch nắp lọc khuẩn 25cm2 với 6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần và mỗi lần nhắc lại là 3 bình ni nhân trên mơi trường Excell 420- 14419C ở nhiệt độ 29 ± 0,50C và pH= 6,2 với hàm lượng tế bào 0,5 x 1010 tế bào/ml.
Thí nghiệm đánh giá hiệu quả bổ sung FBS theo 6 công thức như sau: Công thức 1: Bổ sung vào môi trường nuôi nhân 5% FBS
Công thức 2: Bổ sung vào môi trường nuôi nhân 10% FBS Công thức 3: Bổ sung vào môi trường nuôi nhân 15% FBS Công thức 4: Bổ sung vào môi trường nuôi nhân 20% FBS
52
Công thức 5: Bổ sung vào môi trường nuôi nhân 25% FBS
Công thức 6: Không bổ sung FBS vào môi trường nuôi nhân (Đối chứng) Trước và sau 2, 6 và 10 ngày nhân nuôi tiến hành lấy mẫu đếm số lượng tế bào hình thành có trong 1ml dịch ni trên buồng đếm hồng cầu.
• Đánh giá tiềm năng phát triển sinh khối tế bào khi nuôi nhân in vitro ở
điều kiện thích hợp nhất
Tiến hành theo phương pháp của Lynn et al (2005) [56], thí nghiệm tiến
hành trong 3 đợt vào tháng 10; 11 và 12/ 2016 bằng việc áp dụng các điều kiện thích hợp nhất đã được xác định tư các thí nghiệm đơn lẻ, phát triển sinh khối tế bào trên 5 bình ni nhân loại bình cổ vếch nắp lọc khuẩn 25cm2, sử dụng mơi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 25% FBS ở nhiệt độ 28 ± 0,50C và pH= 6,8 với hàm lượng tế bào 0,5 x 1010 tế bào/ml trước khi đưa vào nuôi nhân.
Trước và sau 1, 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi nhân tiến hành lấy mẫu đếm số lượng tế bào hình thành có trong 1ml dịch ni nhân trên buồng đếm hồng cầu.
• Nghiên cứu nhân sinh khối tế bào sâu khoang với lượng 150ml trên bình lọc khuẩn 250ml theo phương pháp tĩnh và lắc
Từ các kết quả của các thí nghiệm riêng lẻ nêu trên, tiến hành nhân sinh khối tế bào sâu khoang dựa theo phương pháp của Lynn et al. (2005) [56] theo các thông số kỹ thuật tối ưu đã xác định với hàm lượng tế bào ban đầu 0,5 x 1010 tế bào/ml, thực hiện trên bình lọc khuẩn 250ml theo 2 phương pháp tĩnh và lắc với lượng 150ml mơi trường Excell 420-14419C có bổ sung 25% FBS ở nhiệt độ 28 ± 0,50C và pH= 6,8. Công thức nuôi nhân theo phương pháp lắc được tiến hành với tốc độ lắc 50 vịng/phút liên tục 24 giờ. Thí nghiệm với 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần với 1 bình cho mỗi lần nhắc lại.
Cơng thức 1: Nuôi nhân tế bào theo phương pháp tĩnh Công thức 2: Nuôi nhân tế bào theo phương pháp lắc.
Sau 6 ngày nuôi nhân tiến hành lắc với tốc độ lắc 50 vịng/phút trong 5 phút, sau đó lấy mẫu đếm số lượng tế bào hình thành có trong 1ml dịch tế bào trên buồng đếm hồng cầu dưới kính úp soi nổi kết nối với màn hình.
53
• Nghiên cứu nhân sinh khối tế bào sâu khoang theo phương pháp tĩnh và lắc với lượng 750ml mơi trường trên bình 1000ml
Nhằm hướng tới ni nhân tế bào với sinh khối lớn với chi phí thấp bằng các loại môi trường rẻ tiền hơn. Thí nghiệm thực hiện dựa theo phương pháp của Kanokwan et al. (2003), Maiorella et al. (1988) và Miranda et al. (1997) [79, 80,
81]. Ngồi mơi trường thích hợp ni nhân tế bào là môi trường Excell 420- 14419C, đề tài còn tiến hành đánh giá thêm với 2 môi trường rẻ tiền hơn là Schneider S9895 và Grace. Thí nghiệm với lượng 750ml mơi trường có bổ sung 25% FBS trên bình lọc khuẩn Erlemeeyer Flask dung tích 1000ml ở nhiệt độ 28 ± 0,50C, pH= 6,8 với hàm lượng tế bào ban đầu 0,5 x 1010 tế bào/ml.
Tiến hành với 3 cơng thức thí nghiệm, mỗi cơng thức nhắc lại 3 lần là 3 bình nhân sinh khối tế bào theo phương pháp lắc tốc độ 50 vòng/phút liên tục trong 24 giờ (công thức 1) và phương pháp tĩnh (công thức 2).
Công thức 1: + Trên môi trường Excell 420-14419C theo phương pháp tĩnh + Trên môi trường Excell 420-14419C theo phương pháp lắc Công thức 2: + Trên môi trường Schneider S9895 theo phương pháp tĩnh
+ Trên môi trường Schneider S9895 theo phương pháp lắc Công thức 3: + Trên môi trường Grace theo phương pháp tĩnh
+ Trên môi trường Grace theo phương pháp lắc
Sau 2, 6, 10 và 14 ngày nhân nuôi, tiến hành lắc với tốc độ 50 vòng/phút trong 5 phút tạo dịch tế bào dạng huyền phù, sau đó lấy mẫu đếm số lượng tế bào hình thành có trong 1ml dịch tế bào trên buồng đếm hồng cầu dưới kính úp soi nổi kết nối với màn hình.
• Phương pháp đếm tế bào
Phương pháp đếm tế bào được tiến hành theo chỉ dẫn của Lynn (2002) [30]. Cụ thể, để xác định tổng số số lượng tế bào và số tế bào sống trong nuôi cấy được tiến hành qua các bước như sau:
+ Sau khi dịch tế bào được lắc tạo huyền phù trong môi trường, lấy ra 0,2 ml. + Xác định mật độ tế bào sử dụng buồng đếm hồng cầu (buồng đếm Neubauer, là một bản kính dày hình chữ nhật, mặt trên có 2 khu vực có kẻ ơ đếm)
54
Dưới kính hiển vi sẽ thấy rõ cấu tạo của buồng đếm hồng cầu như sau: Buồng đếm được chia thành 9 ơ vng lớn, mỗi ơ có diện tích 1 mm2. Ơ chính giữa được sử dụng để đếm tế bào, các cạnh là những đường song song, được chia thành 25 ơ trung bình, mỗi ơ trung bình được thành 16 ơ nhỏ. Tổng số ơ đếm hồng cầu có 400 ơ nhỏ (mỗi ơ có diện tích 1/400 mm2).
+ Chuẩn bị sẵn dung dịch gồm 0,5 ml Trypan blue 0,4% trộn với 0,3 ml PBS (pH 7,2 - 7,4) trong một ống nghiệm nhỏ.
+ Pha hỗn hợp này với 0,2 ml dịch tế bào.
+ Đưa vào buồng đếm hồng cầu Neubauer (Hình 1.3) và quan sát ngay dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 600X kết nối với máy vi tính. Sau khi nhuộm với Trypan blue, tế bào nào bị nhuộm có màu xanh được xác định là những tế bào chết.
Đếm số lượng tế bào có màu xanh và tổng số tế bào. Đếm trong ô lớn trung tâm, tiến hành đếm 5 ơ trung bình (4 ơ ở bốn góc và 1 ơ ở giữa). Trong mỗi ơ trung bình đếm tất cả 16 ơ nhỏ. Mỗi mẫu được đếm hai lần trên năm khu vực của buồng đếm rồi lấy số liệu trung bình.
% số tế bào sống = [100 - (số tế bào màu xanh/tổng số tế bào)] x 100 Số tế bào trong 1ml mẫu ban đầu được tính:
C (tế bào/ml) = (N x H) x 104
Trong đó: C là số tế bào trong 1ml mẫu ban đầu H là hệ số pha loãng;
N: là Số tế bào trung bình đếm được trên 5 ơ lớn của mẫu đếm.
55
2.4.2.2. Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân ni
• Phương pháp phá vỡ thể vùi trước khi nhiễm virus trên tế bào
Do việc lây nhiễm virus trên tế bào chỉ thực hiện được khi virus ở dạng hoạt động (virion), tức phải tiến hành phá vỡ vỏ bọc protein các thể vùi (Occlusion Bodies). Vì vậy, trước khi thực hiện các thí nghiệm để xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus trên tế bào sâu khoang để phát triển sinh khối NPV, cần tiến hành qua 2 bước: Trước hết, định lượng số lượng thể vùi cần thiết theo yêu cầu của từng thí nghiệm. Sau đó, phải tiến hành bước phá vỡ vỏ bọc protein của thể vùi (Oclussion Bodies) theo phương pháp của Tipvadee et al. (1988) [83]. Bằng cách hoà trộn số thể vùi NPV đã được xác định với dung dịch Na2CO3 0,1M có pH = 11,2 và để yên trong thời gian 15 phút ở nhiệt độ bình thường trong phịng, sau đó lắc với tốc độ 50 vòng/phút trong 3 phút rồi tiếp tục để tiếp 12 phút để tất cả các thể vùi được phá vỡ. Sau đó, tiến hành các thí nghiệm theo mục đích nghiên cứu.
Chủng NPV sử dụng trong tất cả các thí nghiệm lây nhiễm là chủng TL.1a vì đây là chủng có hoạt lực cao ổn định đã được lựa chọn sau khi tuyển chọn.
• Xác định nồng độ tế bào thích hợp cho lây nhiễm
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Lynn (2002) [30] với 4 cơng thức thí nghiệm tương ứng với 4 cơng thức nồng độ tế bào khác nhau trên mơi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 15% FBS và pH= 7,0 ở nhiệt độ 28 ± 0,50C. Mỗi cơng thức thí nghiệm tiến hành nhắc lại 3 lần trên khay 12 giếng với số lượng thể vùi để lây nhiễm ở các công thức là 0,1 x 108 OB/ml. Các cơng thức thí nghiệm tiến hành gồm:
Công thức 1: Lây nhiễm ở nồng độ 1,0 x 108 tế bào/ml Công thức 2: Lây nhiễm ở nồng độ 2,0 x 108 tế bào/ml Công thức 3: Lây nhiễm ở nồng độ 3,0 x 108 tế bào/ml
Công thức 4: Công thức đối chứng là dịch tế bào không nhiễm NPV.
Sau 3 và 6 ngày thì tiến hành lấy mẫu xác định số lượng thể vùi hình thành trong dịch nhiễm theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu Neubauer ở mỗi lần nhắc lại của các cơng thức thí nghiệm trên kính hiển vi.
56
• Xác định hàm lượng thể vùi NPV thích hợp cho lây nhiễm
Thí nghiệm được bố trí với 4 cơng thức thí nghiệm tương ứng với 3 chỉ số MOI khi lây nhiễm. Chỉ số MOI là tỷ lệ giữa số thể vùi NPV và số tế bào sâu khoang có trong mơi trường nuôi nhân theo phương pháp của Lynn (2003) [85]. Mỗi cơng thức thí nghiệm được nhắc lại 3 lần trên khay 12 giếng trên môi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 15% FBS và pH= 7,0 ở nhiệt độ 28± 0,50C. Dịch tế bào để nhiễm virus có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml.
Công thức 1: Lây nhiễm theo chỉ số MOI = 0,1 Công thức 2: Lây nhiễm theo chỉ số MOI = 0,3 Công thức 3: Lây nhiễm theo chỉ số MOI = 0,5
Công thức 4: Dịch tế bào không nhiễm vi rút (đối chứng).
Sau 3 và 6 ngày thì tiến hành lấy mẫu xác định số lượng thể vùi hình thành theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu Neubauer ở mỗi