Các kết quả nghiên cứu ở các nước đều khẳng định liều lượng sử dụng NPV phải tính theo tổng lượng thể vùi cho 1 ha cây trồng, liều lượng thể vùi cần phun cho 1 ha cây trồng để trừ sâu hại tùy theo từng đối tượng sâu hại khác nhau, đối với sâu khoang và sâu keo da láng, tới 9,0 x 1011 OB/ha, còn đối với sâu xanh phải từ 1,5- 3,0 x 1012 OB/ha tùy theo từng loại cây trồng [12, 32, 34, 89, 115, ....].
Như vậy, việc tạo dạng sản phẩm để sử dụng phịng trừ sâu hại chủ đích có thể có những khác nhau, nhưng nhiều tác giả đều khẳng định liều lượng sản phẩm sử dụng có thể nhiều hay ít tùy theo cơng nghệ tạo dạng, nhưng cần phải đảm bảo được số lượng thể vùi phun rải cho 1 ha đối với từng loài sâu hại cụ thể. Điều đó địi hỏi ngun liệu thể vùi NPV phải được định lượng một cách chủ động trước khi tạo dạng. Có như vậy mới có thể đảm bảo chế phẩm có chất lượng ổn định và hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại khi sử dụng trên đồng ruộng.
Theo Lynn (2002) [30], Huda et al. (2012) [118], Nazli et al. (2012) [119]
thì SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) là một tác nhân tạo sủi với pH =7,0 nên rất hiệu quả trong việc phân lập thể vùi tinh từ dịch thể vùi sau khi nhiễm NPV vì SDS có tác dụng giúp cân bằng sinh lý tế bào, không gây phá vỡ vỏ protein của thể vùi và chống hiện tượng kết mảng thể vùi sau khi phân lập thể vùi tinh.
Sajap et al. (2000) [14] cho rằng sử dụng SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) để thu hoạch thể vùi tinh từ dịch nhiễm vừa có hiệu quả cao do chúng làm cho thể vùi tách rời nhau, vừa dễ phân bố đồng đều trong phụ gia khi tạo dạng sản phẩm. Đồng thời, bằng kỹ thuật thu hoạch thể vùi tinh còn tạo điều kiện bảo quản hiệu quả lâu dài và dễ dàng vận chuyển đi xa đến nơi tiêu thụ sản phẩm mới tạo dạng mà chưa cần phải tạo dạng sử dụng sản phẩm ngay.
Nhận thức rõ việc xác định được kỹ thuật phân lập thể vùi tinh là khâu kỹ thuật hết sức quan trọng và có tính thực tiễn cao trong chuỗi công đoạn của quá trình phát triển chế phẩm NPV. Tuy nhiên, vấn đề này chưa có tài liệu nào công bố một cách đầy đủ. Để đạt được điều này, đề tài đã cố gắng tìm giải pháp tinh sạch để
111
thu hoạch thể vùi từ dịch tế bào đã nhiễm vi rút bằng các phương thức ly tâm 1.500 vòng/phút bằng nước cất kết hợp sử dụng SDS 0,1%, mỗi lần ly tâm với nước cất hoặc SDS trong thời gian 5 phút.
Kết quả thí nghiệm với 7 cơng thức tinh sạch thể vùi khác nhau đối với dịch thể vùi NPV thu hoạch sau khi nhiễm trên tế bào nhân nuôi được qua xác định đạt 2,8 x 108 OB/ml ở thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm. Kết quả bảng 3.24 cho thấy khi tinh sạch thể vùi, nếu sử dụng từ 2 – 4 lần nước cất vơ trùng thì số lượng thể vùi tinh thu được từ 1,04 - 1,80 x 108 OB/ml. Điều đó có nghĩa lượng thể vùi bị loại bỏ đi khá nhiều, tỷ lệ thu hồi chỉ đạt 37,14- 64,29% số thể vùi có được trước khi đưa vào tinh sạch (Bảng 3.24).
Nếu áp dụng tinh sạch 2 lần, gồm 1 lần nước cất vô trùng và 1 lần SDS 0,1% và ly tâm trong thời gian 5 phút sau mỗi lần pha loãng, hàm lượng thể vùi tinh thu được đạt từ 2,33 x 108 OB/ml, tức thu hồi được 83,21% lượng thể vùi trước tinh sạch. Nếu thực hiện 3 lần gồm: 2 lần nước cất xen kẽ với 1 lần SDS và ly tâm trong thời gian 5 phút/lần thì lượng thể vùi thu hồi được là cao nhất, tới 2,71 x 108 OB/ml với tỷ lệ thu hồi thể vùi đạt 96,79% lượng thể vùi ban đầu.
Khi sử dụng 4 lần, gồm: 2 lần SDS 0,1% xen kẽ với 2 lần nước cất và ly tâm trong thời gian 5 phút/lần thì hàm lượng thể vùi có thể đạt 2,10 x 108 OB/ml, với tỷ lệ thu hồi 75,0%. Thực hiện 5 lần, gồm: 2 lần SDS xen kẽ với 3 lần nước cất, số lượng thể vùi thu hồi được là 2,35 x 108 OB/ml, tương đương tỷ lệ thể vùi thu hồi đạt 83,93% (Bảng 3.26).
Như vậy, thực hiện tinh sạch 2 lần bằng nước cất xen kẽ với 1 lần SDS và ly tâm trong thời gian 5 phút với tốc độ 1.500 vòng/phút sau mỗi lần pha lỗng thì lượng thể vùi thu hồi đạt cao nhất, tới 2,71 x 108 OB/ml tương ứng với tỷ lệ thu hồi thể vùi đạt 96,79% so với số lượng thể vùi ban đầu có trong dịch nhiễm.
Cách làm này cho phép tỷ lệ thu hồi thể vùi cao hơn so với phương pháp của Kanokwan et al. (2004) [89] khi tinh sạch thể vùi NPV bằng cách ly tâm với tốc độ cao tới 5.000 vịng/phút để loại bỏ mơi trường khi lây nhiễm, sau đó ly tâm lại bằng nước cất, thì tỷ lệ thu hồi thể vùi chỉ đạt 90,5%. Tuy nhiên, qui trình thực hiện của Kanokwan et al. (2004) đơn giản, ít phức tạp hơn vì chỉ cần thực hiện qua 2 bước là
112 hoàn thành việc tinh sạch [89].
Bảng 3.24. Số lượng thể vùi sâu khoang và tỷ lệ thu hồi sau tinh sạch theo các phương pháp khác nhau
Công thức
Phương pháp tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang
Số lượng thể vùi (x 108 OB/ml) Tỷ lệ thu hồi (%) 1 2 lần bằng nước cất 1,04 a 37,14 2 3 lần bằng nước cất 1,50 b 53,57 3 4 lần bằng nước cất 1,80 c 64,29 4 2 lần: nước cất - SDS 2,33 d 83,21 5 3 lần: nước cất- SDS- nước cất 2,71 e 96,79 6 4 lần: SDS- nước cất- SDS- nước cất 2,40 d 85,71
7 5 lần: nước cất- SDS- nước cất- SDS- nước cất 2,35 d 83,93
CV (%) 64,40 -
LSD0,05 0,936 -
Ghi chú: SDS: Sodium Dodecyl Sulfate; OB: Thể vùi. Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05.
Các thể vùi NPV sau khi tinh sạch có màu trắng đục dạng bột nhão, dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 200X và 600X (Hình 3.8)
Hình 3.10: Thể vùi NPV sâu khoang sau khi tinh sạch khi quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 200X và 600X
Với lượng thể vùi thu được qua tinh sạch sẽ rất dễ dàng cho việc tạo sản phẩm dạng bột thấm nước, dịch lỏng hoặc để đông khô phục vụ bảo quản lâu dài vì thể tích để bảo quản thể vùi tinh sẽ ít hơn (Hình 3.9). Vì từ dịch thể tế bào nuôi
113
nhân sau khi nhiễm virus NPV (sản xuất theo công nghệ tế bào) hoặc từ dịch nghiền sâu non chết sau khi nhiễm NPV (sản xuất theo công nghệ truyền thống), sau khi tinh sạch thể vùi sẽ cho phép dễ dàng trong bảo quản và tạo dạng sử dụng chế phẩm khác nhau với hàm lượng thể vùi như đã được dự kiến cho 1 ha cây trồng cần phòng trừ sâu khoang. Đặc biệt, dễ dàng tạo dạng bột thấm nước với hàm lượng thể vùi trong chế phẩm như mong muốn.
• Giám định DNA của NPV ni nhân trên tế bào và trên sâu chết
Phân tích PCR đối với 4 mẫu NPV sâu khoang nhân trên tế bào (ký hiệu SplNPV từ 2-5) và 1 mẫu đối chứng là NPV từ sâu non chết bệnh thu từ ruộng bắp cải (SplNPV 6). Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra trong Agarose gel, được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification (Qiagen, Đức) được gửi giải trình tự trực tiếp 2 chiều theo phương pháp Sanger tại Viện Công nghệ sinh học và sự sống (Hàn Quốc). Các trình tự được BLAST so sánh bằng công cụ trực tuyến trên Ngân hàng gen (NCBI) và so sánh với 9 trình tự gen SplNPV đã cơng bố của các nước Ấn độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đức, Australia và Pháp cùng với trình tự gen của virus NPV trên sâu chết bệnh và virus hạt PiraGV trên sâu Pieris rapae làm đối chứng.
Khoảng cách di truyền giữa các trình tự được xác định dựa trên mơ hình thay thế Kimura, độ tin cậy của các nhánh được xác định bằng giá trị bootstrap, biểu diễn bằng giá trị % với 1000 lần lặp lại trong phần mềm MEGA 6.0.
Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR các mẫu NPV trên tế bào và trên sâu
M 1 2 4 5 6
510 bp
M: Marker, 100 bp, Fermentas; 1: H2O (negative control); Mẫu 2- 5: NVP tế bào; Mẫu 6: NPV của sâu non bị bệnh Mẫu 2- 5: NVP tế bào; Mẫu 6: NPV của sâu non bị bệnh
114
Bảng 3.25. Các chủng NPV sâu khoang sử dụng trong phân tích phả hệ
Nguồn vi rút Tên mẫu
phân tích
Mã số
GenBank Nguồn gốc
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene
Từ SplNPV-2
đến NPVSpl-5 - Việt Nam
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene
NPVSpl-6
(sâu chết bệnh) - Việt Nam
Spodotera litura nuclear polyhydrosis
virus polh gene for polyhedrin SpltNPV-In X94437 Ấn Độ
Spodoptera litura NPV gene for
polyhedron SpltNPV-Jap AB326102 Nhật Bản
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene SpltNPV-Kore DQ152923 Hàn Quốc
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene SpltNPV-Kore DQ350142 Hàn Quốc
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene SpltNPV-Ger AY706714 Đức
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene SpltNPV- Ger AY706715 Đức
Spodoptera litura nuclear polyhedrosis
virus polyhedrin (polh) gene SpltNPV-Aus AF068189 Australia
Spodoptera littoralis NPV gene for
nuclear polyhedron SpltNPV- Fra D01017 Pháp
Pieris rapae granloviruses PiraGV AY706673 -
Qua so sánh, cả 4 mẫu NPV (ký hiệu Splt 2 đến 5) ni nhân trên tế bào đều có trình tự gen hồn tồn tương tự với NPV trên sâu chết bệnh (ký hiệu SpltNPV- 6) với độ tương đồng 100% giữa các mẫu phân tích (hình 3.9) và có độ tương đồng 100% khi so sánh trình tự gen NPV trên ngân hàng GenBank, cùng nhánh với trình tự gen NPV trên sâu khoang Ấn Độ (Hình 3.10), đều thuộc lồi Spodoptera litura Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV sâu khoang), giống Alphabaculovirus, họ Baculoviridae.
115
Hình 3.12. Cây phả hệ dựng theo phương pháp Neighbor-joining.
Ghi chú: So sánh trình tự gen polh với các đại diện từ Ngân hàng Gen. Mẫu vi rút
NPV sâu khoang của Việt Nam được in đậm (mũi tên). Tên mẫu phân tích được chỉ rõ ở bảng 1, mã số Ngân hàng Gen đặt trong dấu ngoặc đơn. Virus Pieris rapae granuloviruses của sâu xanh bướm trắng được đưa vào làm đối chứng. Gốc nhánh là giá trị thống kê Bootstrap với 1000 lần lặp (chỉ ghi những giá trị lớn hơn 80%). Thước đo khoảng cách di truyền 5%.