• Phân lập chủng NPV và đánh giá hoạt lực gây chết sâu khoang
Tác giả Grzywacz et al. (2008) chỉ rõ rằng khi phát triển sinh khối NPV để
phòng trừ sâu hại, khâu đầu tiên là phải phân lập, tuyển chọn được chủng có hoạt tính cao, ổn định và tốt nhất nên phân lập từ sâu chết NPV ngoài tự nhiên của vùng nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sau này [34]. Khattab (2013) đã thực hiện qui trình phân lập tuyển chọn NPV của sâu xanh da láng Spodoptera exigua (Lepidoptera:
Noctuidae) trên cơ sở lây nhiễm NPV trên sâu non, khi sâu chết cho từng cá thể sâu chết riêng rẽ vào ống nghiệm và ngâm trong nước. Khi thể vùi giải phóng hết thì tiến hành lọc ly tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 20 phút để tinh sạch thể vùi. Sau đó đếm số lượng thể vùi và xác định tỷ lệ sâu chết. Các bước phân lập tiếp theo được lặp lại như bước đầu tiên [112].
Từ các mẫu thể vùi hình thành từ sâu bị bệnh thu được qua điều tra, thu thập trong năm 2015 trên bắp cải và lạc tại Đông Anh, Mê Linh (Hà Nội), lạc và khoai sọ tại Yên Phong (Bắc Ninh). Qua lây nhiễm lại trên sâu khoang khoẻ, sạch bệnh, các cá thể sâu chết đều có triệu chứng sâu chết treo mình ở mặt dưới lá, tồn thân mọng nước, xử lý trong phịng thí nghiệm và lựa chọn các cá thể sâu chết bệnh có khối lượng thể vùi hình thành lớn. Kết quả đã xác định các mẫu thu trên ruộng bắp cải, lạc và cây khoai sọ để phân lập tuyển chọn chủng có tiềm năng.
Sử dụng các nguồn thể vùi tinh phân lập được tiến hành lây nhiễm trên sâu khoẻ để đánh giá hiệu quả diệt sâu và khả năng hình thành thể vùi. Kết quả (Bảng 3.3) cho thấy sau 3 ngày lây nhiễm, hiệu lực gây chết sâu khoang đạt thấp chỉ từ 14,29 đến 30,61%, đến thời điểm sau 7 ngày lây nhiễm vi rút thì hiệu lực gây chết
72
sâu khoang ở tất cả các nguồn NPV tăng lên rõ rệt đạt từ 22,45 đến 55,56%. Vào thời điểm 10 ngày sau nhiễm hiệu lực gây chết sâu khoang của các nguồn đạt cao nhất từ 55,0 – 80,0% (Bảng 3.3).
Trong số các nguồn vi rút từ sâu khoang chết trên 3 loại cây trồng, nhận thấy nguồn NPV trên bắp cải có 3 mẫu NPV có hoạt lực gây chết sâu cao là NPV1.3, NPV1.5 và NPV1.6 với tỷ lệ sâu chết tương ứng đạt 80,0; 77,5 và 75,0% và khả năng hình thành thể vùi tương ứng đạt 2,64; 1,80 và 1,95 x 108 OB/10 sâu. Nguồn NPV trên lạc có 2 mẫu NPV có tiềm năng là NPV2.1 và NPV2.2, hiệu lực tương ứng đạt 77,50% và 77,50% và hàm lượng thể vùi đạt 1,87 và 1,80 x 108 OB/10 sâu. Còn với nguồn NPV trên khoai sọ, chỉ xác định có 1 mẫu có tiềm năng là NPV3.2 với hiệu lực gây chết sâu đạt 77,50% và khả năng hình thành thể vùi đạt 1,75 x 108 OB/10 sâu sau phân lập lần 1. Trong khi đó, hiệu lực gây chết sâu khoang của nguồn NPV từ quĩ gen chỉ đạt cao nhất 48,79% ở thời điểm 10 ngày sau xử lý và số lượng thể vùi chỉ đạt 1,02 x 107 OB/10 sâu (Bảng 3.3). Tuy nhiên, với tỷ lệ sâu chết do NPV và mức độ phổ biến của chúng trên lạc và đậu tương có xu hướng gần tương tự nhau, vì vậy cần tiếp tục phân lập, đánh giá đối với nguồn NPV trên đậu tương để có thể tuyển chọn được chủng NPV có tiềm năng cao.
Kết quả trên cho thấy giữa các nguồn NPV và giữa các cá thể sâu chết bệnh sau khi phân lập lần 1 có hiệu quả gây chết sâu khoang và tiềm năng hình thành thể vùi rất khác nhau, thể hiện tính đa dạng sinh học của NPV ngoài tự nhiên. Kết quả thí nghiệm hồn tồn phù hợp với kết quả công bố của Trần Văn Hai và cộng sự
(2010) [104]; Farrar và Ridgway (1999) [32] và Grzywacz et al. (1996) [12] chỉ rõ
sự khác nhau về hiệu lực trừ sâu khoang của NPV có nguồn gốc thu thập khác nhau. Theo Grzywacz et al. (1996) [12]; Sajap et al., (2000) [14]; Senthil Kumar et
al., (2005) [113]; Sireesha et al., (2010) [114], chủng NPV được tuyển chọn phải đảm bảo vừa có độc tính cao, vừa có khả năng sinh thể vùi lớn mới có ý nghĩa trong phát triển chế phẩm sinh học vì hiệu quả diệt sâu và tiềm năng ứng dụng của chế phẩm NPV tạo ra tuỳ thuộc rất nhiều vào 2 chỉ tiêu này. Điều đó cho thấy sự cần thiết của việc nghiên cứu phân lâp và tuyển chọn chủng NPV khi thu thập mẫu trên cây trồng ngoài đồng ruộng.
73
Bảng 3.3. Số thể vùi hình thành và hiệu lực gây chết sâu khoang ở các ngày sau lây nhiễm của các chủng NPV sau phân lập lần 1
Chủng NPV
Số thể vùi hình thành (OB/10 sâu)
Hiệu lực trừ sâu (%) ở các ngày sau lây nhiễm (NSN)
3 ngày 7 ngày 10 ngày
Bắp cải NPV1.1 1,50 x 108 14,29 37,78 62,50 NPV1.2 1,40 x 108 30,61 33,33 60,00 NPV1.3 2,64 x 108 18,37 30,61 80,00 NPV1.4 1,00 x 108 14,29 53,33 62,50 NPV1.5 1,80 x 108 20,41 55,56 77,50 NPV1.6 1,95 x 108 26,53 44,44 75,00 Lạc NPV2.1 1,87 x 108 18,37 51,11 77,50 NPV2.2 1,80 x 108 14,29 55,56 77,50 NPV2.3 1,56 x 108 20,41 33,33 55,00 NPV2.4 1,55 x 108 14,29 30,61 60,00 Khoai sọ NPV3.1 1,60 x 108 30,61 40,00 62,50 NPV3.2 1,75 x 108 14,29 22,45 77,50 NPV3.3 1,50 x 108 22,45 46,67 62,50 ĐC 1 QG.NPV 1,02 x 107 20,12 34,26 48,79 ĐC 2 Sâu khoẻ - - - -
Ghi chú: NSN: Ngày sau nhiễm,
QG.NPV: Nguồn NPV từ quĩ gen
ĐC 2: Đối chứng sâu khoẻ được xử lý bằng nước cất
74
Tiếp tục tiến hành phân lập các chủng NPV điển hình, gồm 3 chủng từ NPV- 1 trên bắp cải, 2 chủng trên lạc và 1 chủng trên khoai sọ, qua đánh giá hiệu lực trừ sâu trên sâu non sạch bệnh được nuôi trong phịng nhằm lựa chọn được chủng NPV có hoạt lực trừ sâu cao và có khả năng sinh thể vùi lớn. Kết quả tuyển chọn sau phân lập lần 2 xác định được 10 chủng có nguồn gốc từ NPV1 (bắp cải), 10 chủng có nguồn gốc từ NPV2 (lạc) và 3 chủng có nguồn gốc từ NPV-3 (khoai sọ).
Đánh giá lại hiệu quả gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi đối với các chủng đã lựa chọn đã xác định sau phân lập lần 2, kết quả (Bảng 3.4) cho thấy:
Có 5 chủng phân lập có nguồn gốc từ NPV1 là NPV1.3.1; NPV1.5.1; NPV1.5.2; NPV1.6.1 và NPV1.6.2 với khả năng sinh thể vùi đạt từ 1,75- 2,59 x 108 OB/10sâu và tỷ lệ trừ sâu khoang từ 70,0- 77,5%. Nổi bật nhất là chủng NPV1.3.1 đạt hiệu quả trừ sâu 77,7% và thể vùi đạt 2,59 x 108 OB/10 sâu.
Với nguồn phân lập từ NPV2 đã xác định có 5 chủng có gồm: NPV2.1.1; NPV2.1.2; NPV2.1.10; NPV2.2.1 và NPV2.2.2 với khả năng sinh thể vùi từ 1,8- 2,5 x 108 OB/10sâu và tỷ lệ trừ sâu khoang đạt từ 71,42- 77,14%. Trong số đó, nổi bật nhất là chủng NPV2.1.1 có khả năng sinh thể vùi tới 2,5 x 108 OB/10sâu và hiệu quả gây chết sâu tới 77,14%.
Trong khi đó, với các nguồn phân lập từ NPV3 trên khoai sọ, khi phân lập lần 1 đã xác định được 1 chủng có hoạt lực cao là NPV3.2, nhưng sau khi phân lập lần 2 chỉ xác định được 1 chủng điển hình có hoạt lực cao là NPV3.1.1 với khả năng sinh thể vùi đạt 1,9 x 108 OB/10 sâu và tỷ lệ trừ sâu đạt tới 74,29%. Hai chủng còn lại là NPV3.1.7 và NPV3.1.9 có khả năng sinh thể vùi đạt tương ứng là 1,54 và 1,65 x 108 OB/10sâu và hiệu quả trừ sâu chỉ đạt 51,43 và 42,86% (tương ứng).
Kết quả thí nghiệm (Bảng 3.4) đã cho thấy sự đa dạng các chủng NPV sâu khoang thể hiện rõ qua mức độ rất khác nhau về hiệu lực trừ sâu và khả năng sinh thể vùi của các chủng sau khi phân lập. Kết quả thu được cũng hoàn toàn phù hợp với các nhận xét và kết quả công bố của Trần Văn Hai và cộng sự (2010) [104] khi đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang và số thể vùi hình thành của các chủng NPV qua phân lập từ các nguồn NPV thu từ 5 tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, cũng như kết
75
quả công bố của Farrar và Ridgway (1999) [32]; Grywacz et al. (1996) [12], Senthil Kumar et al. (2005) [112] và Sireesha et al. (2010) [113].
Bảng 3.4. Số thể vùi hình thành và hiệu lực gây chết sâu khoang sau lây nhiễm 7 ngày của các chủng NPV sau phân lập lần 2
Nguồn phân lập từ NPV1 (trên bắp cải) Nguồn phân lập từ NPV2 (trên lạc) Nguồn phân lập từ NPV3 (trên khoai sọ) Chủng Số thể vùi hình thành (x108OB /10sâu) Tỷ lệ sâu chết (%) Chủng Số thể vùi hình thành (x108OB /10sâu) Tỷ lệ sâu chết (%) Chủng Số thể vùi hình thành (x108OB /10sâu) Tỷ lệ sâu chết (%) NPV1.3.1 2,59 75,00 NPV2.1.1 2,50 77,14 NPV3.1.1 1,90 74,29 NPV1.5.1 1,90 70,00 NPV2.1.2 1,80 71,43 NPV3.1.7 1,54 51,43 NPV1.5.2 2,00 70,00 NPV2.1.5 1,75 57,14 NPV3.1.9 1,65 42,86 NPV1.5.3 1,60 55,00 NPV2.1.6 1,58 51,43 NPV1.5.5 1,60 52,50 NPV2.1.9 2,25 42,86 NPV1.5.6 1,50 50,00 NPV2.1.10 2,50 74,29 NPV1.5.7 1,50 42,50 NPV2.1.11 1,40 57,14 NPV1.6.1 1,90 77,50 NPV2.2.1 1,85 71,42 NPV1.6.2 1,75 70,00 NPV2.2.2 2,00 74,26 NPV1.6.3 1,60 57,50 NPV2.2.7 1,50 57,14 ĐC 1 QG.NPV 1,10 35,02 ĐC 1 QG.NPV 1,10 35,02 ĐC 1 QG.NPV 1,10 35,02 ĐC 2 - - ĐC 2 - - ĐC 2 - -
Ghi chú: ĐC 1 - QG.NPV: Nguồn NPV từ quĩ gen.
ĐC 2: Đối chứng sâu khoẻ được xử lý bằng nước cất
Với phương pháp tiến hành thí nghiệm phân lập tương tự như đã nêu với lần phân lập lần 1 và 2, sau chu kỳ phân lập lần 3 và tiếp tục phân lập lần 4 đã chọn lọc được 3 chủng NPV có tiềm năng cao, gồm các chủng mang mã số: NPV1.3.1.1.2 (ký hiệu: TL.1a); NPV2.1.1.1.3 (ký hiệu: TL.2a) và NPV3.1.1.1.3 (ký hiệu: TL3a) có khả năng sinh thể vùi tương ứng đạt 2,9; 1,8 và 2,8 x 108 OB/10sâu, hiệu lực trừ sâu khoang của các chủng đạt tương ứng 80,09; 75,56 và 80,00% (Bảng 3.5).
76
Trong khi đó, hiệu lực trừ sâu khoang của chủng NPV lấy từ bộ sưu tập quĩ gen (mã hiệu: QG.NPV) chỉ đạt 36,01% và khả năng hình thành thể vùi cũng chỉ đạt 1,1 x 107 OB/10 sâu. Chủng QG.NPV trong thí nghiệm có hoạt lực thấp, có thể chủng virus này không được phục tráng định kỳ hàng năm trong 3 năm gần đây nên hoạt lực của nó bị suy giảm, mặc dù khi được lựa chọn bảo quản thì hiệu quả trừ sâu khoang cũng đạt tới 79,6% (Bảng 3.5).
Cả 3 chủng vi rút NPV sau khi đã được phân lập, đánh giá và nhân sinh khối thể vùi đã được bổ sung lưu giữ trong bộ sưu tập quĩ gen vi sinh vật có ích của Viện Bảo vệ thực vật phục vụ nghiên cứu và phát triển thuốc sinh học sau này.
Bảng 3.5. Số thể vùi hình thành và hiệu lực gây chết sâu khoang sau 7 ngày lây nhiễm của các chủng NPV điển hình sau phân lập lần thứ 4
TT Chủng lựa chọn sau phân lập Ký hiệu chủng Số thể vùi hình thành (OB/10 sâu) Hiệu lực trừ sâu (%) 1 NPV1.3.1.1.2 TL.1a 2,9 x 108 c 80,09 2 NPV2.1.1.1.3 TL.2a 1,8 x 108 b 85,56 3 NPV3.1.1.1.3 TL.3a 2,8 x 108 c 80,00 4 Đối chứng QG.NPV 1,1 x 107 a 36,01 CV% - 31.77 35,20 LSD0,05 - 17,29 20,34
Ghi chú: OB: thể vùi; QG.NPV: Nguồn NPV từ quĩ gen.Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05.
• Hiệu lực gây chết sâu khoang của các chủng NPV sau tuyển chọn
Một thí nghiệm đánh giá lại nhằm khẳng định tính ổn định về khả năng gây chết sâu khoang và hàm lượng thể vùi hình thành của các chủng NPV sau khi phân lập đã được lựa chọn. Kết quả cho thấy chủng TL.1a vẫn thể hiện tính ổn định với tỷ lệ gây chết sâu đạt tới 80,0% sau 10 ngày lây nhiễm và số lượng thể vùi hình thành vẫn ổn định đạt mức cao nhất, tới 2,0 x 108 OB/10 sâu (Bảng 3.6).
Trong khi đó, số thể vùi hình thành của chủng TL.2a đạt thấp nhất chỉ đạt 1,60 x 108 OB/10 sâu và hiệu lực gây chết sâu khoang chỉ đạt 68,33%. So với kết quả đánh giá sau phân lập lần 4 (1,8 x 108 OB/10 sâu và 85,56%), qua đánh giá lại
77
thì hoạt lực của chủng TL.2a có sự thay đổi đáng kể. Điều này cũng diễn ra tương tự với chủng TL.3a, số thể vùi hình thành của chủng TL.3a đạt 2,8 x 108 OB/10 sâu và hiệu lực trừ sâu chỉ đạt 73,33%, thấp hơn một cách đáng kể so với kết quả đánh giá sau phân lập lần 4 (2,8 x 108 OB/10 sâu và 80,0%). Điều đó chứng tỏ 2 chủng NPV này vẫn chưa thật sự ổn định về khả năng gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi qua các lần phân lập (Bảng 3.6).
Bảng 3.6. Số thể vùi hình thành và hiệu lực gây chết sâu khoang sau 7 ngày lây nhiễm của các chủng NPV đã được lựa chọn
Ghi chú: Đ/C: Đối chứng xử lý bằng nước cất; OB: Thể vùi. Trong cùng cột,
các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05.
Kết quả thí nghiệm đã chứng tỏ chủng TL.1a có hoạt lực ổn định qua các lần đánh giá phân lập và có khả năng sinh thể vùi cao, nên được lựa chọn sử dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào, cũng như nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước. Hai chủng còn lại TL.2a và TL.3a thể hiện hoạt lực không ổn định và cần tiếp tục phân lập, để có được chủng có hoạt lực cao và ổn định hơn.
Kết quả ảnh chụp thể vùi (OB) dưới kính hiển vi với độ phóng đại 600X cho thấy rõ (Hỉnh 3.4), thể vùi (OB) có hình dạng hình khối khơng đều và nổi rõ các thể hoạt động ở bên trong, có kích thước 150 x 350nm. Thể hoạt động (virion) của NPV dưới hiển vi điện tử (TEM) tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (Hà Nội), thể hoạt
Công thức Số thể vùi lây nhiễm (x 108 OB/ml) Số sâu lây nhiễm (con) Số thể vùi hình thành (x 108 OB/10 sâu) Hiệu lực trừ sâu (%) TL.1a 1,50 300 2,60 80,00 a TL.2a 1,50 300 1,60 68,33 c TL.3a 1,50 300 1,85 73,33 b Đ/C Nước cất 300 - - CV% - - 0.71 LSD 0,05 - - 1,20
78
động (virion) với độ phóng đại 25.000X của chủng TL.1a có dạng hình trụ với kích thước 44,7 nm x 341nm. Kết quả quan sát được cũng tương tự như với kết quả đã công bố của các tác giả Grzywacz et al., (1996) [12] và Rohrmann và George
(2011) [5] là kích thước thể vùi (OB) thường nằm trong khoảng 240- 400nm và của thể hoạt động (virion) từ 40- 70 x 320- 450nm.
Hình 3.4. Thể thể vùi (OB) và thể hoạt động (virion) của chủng TL.1a A: Thể vùi (OB) và thể hoạt động với độ phóng đại 600X B: Thể virus hoạt động (virion) với độ phóng đại 25.000X