• Điều tra mức độ phổ biến của NPV trên sâu khoang ngoài đồng ruộng
Điều tra mức độ phổ biến của sâu khoang chết bệnh được tiến hành theo phương pháp điều tra cơ bản sâu bệnh hại cây trồng của Viện Bảo vệ thực vật
45
(1997) [108] và theo QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT [110] về phương pháp điều tra sinh vật hại cây trồng. Thực hiện điều tra 3 lần vào tháng 10/2014, tháng 3 và tháng 4 năm 2015 trên đồng ruộng trồng bắp cải tại Đông Anh và đậu tương tại Mê Linh (Hà Nội), lạc và khoai sọ tại Yên Phong (Bắc Ninh).
Tại mỗi vùng sản xuất, chọn 3 khu đồng đại diện cho hiện trạng sản xuất (địa hình, mức độ thâm canh). Tại mỗi khu đồng, tiến hành điều tra 3 ruộng, tại mỗi ruộng điều tra 5 điểm theo đường chéo góc, mỗi điểm điều tra 1m2 cây trồng. Ghi chép số sâu khoang sống và chết tại các điểm điều tra.
Đồng thời, thu thập tất cả các cá thể sâu khoang sống tại điểm điều tra để trong hộp riêng có chứa thức ăn cho sâu là cây trồng của ruộng điều tra. Sau đó, đem về phịng thí nghiệm tiếp tục ni theo dõi cho đến khi sâu hoá nhộng để xác định cá thể sâu nhiễm NPV được tiến hành theo phương pháp của Viện Bảo vệ thực vật (2000) có tham khảo phương pháp nghiên cứu của Hong (2002), Grzywacz et al. (1996) và Evans (1986) [109, 2, 12, 27].
Những cá thể sâu chết được thu thập xử lý vô trùng bằng cồn 900 trong 30 giây, để khô và cho riêng rẽ từng cá thể sâu chết vào từng ống nghiệm loại 5ml. Sau đó, cho 3ml nước cất vô trùng vào mỗi ống nghiệm đựng mẫu, nút kín và ngâm trong 7 ngày để thể vùi NPV lắng đọng xuống đáy ống nghiệm. Những cá thể sâu ngâm trong nước có thể vùi màu trắng đục hình thành và lắng đọng xuống đáy ống nghiệm được xác định cá thể sâu đó đã nhiễm NPV ngồi đồng ruộng.
Đánh giá độ bắt gặp và tần xuất xuất hiện của sâu chết do NPV được xác định như sau:
Số điểm điều tra bắt gặp
Độ bắt gặp P(%) = -------------------------------- x 100 Tổng số điểm điều tra
Mức độ phổ biến của NPV trên sâu khoang ngoài đồng ruộng được đánh giá theo thang bậc sau:
-: Rất ít phổ biến với độ bắt gặp/tần suất xuất hiện đạt <5% +: Ít phổ biến với độ bắt gặp/tần suất xuất hiện đạt 5- <25%
46
+++: Phổ biến với độ bắt gặp/tần suất xuất hiện đạt 50- <75% ++++: Rất phổ biến với độ bắt gặp/tần suất xuất hiện đạt >75%
• Phân lập, tuyển chọn chủng NPV sâu khoang có hoạt lực cao
Các mẫu sâu khoang bị bệnh thu được qua điều tra tại Đông Anh, Mê Linh và Tiền Phong (Hà Nội). Phân lập thể vùi của sâu bị bệnh theo phương pháp của Grzywacz et al. (1996) và Escribano et al. (1999) [12, 39], được tiến hành tại phịng thí nghiệm sinh học của Viện Bảo vệ thực vật.
Phương pháp phân lập thể vùi NPV được tiến hành cụ thể như sau:
Quan sát và lựa chọn các cá thể sâu có triệu chứng nhiễm bệnh NPV tự nhiên ngoài đồng ruộng (cơ thể sâu chết căng mọng, chúc đầu treo mình trên lá cây, ...) sau khi ngâm nước trong 7 ngày để thể vùi màu trắng đục lắng đọng ổn định xuống đáy ống nghiệm. Sau đó, tiến hành nghiền sâu trong dung dịch SDS 0,1% và ly tâm với tốc độ 1.500 vòng/phút trong thời gian 10 phút, thu phần cặn lắng màu trắng đục chính là thể vùi của NPV. Lọc loại bỏ bã xác sâu và phần dịch nổi bên trên.
Thu phần thể vùi của NPV rồi tiếp tục bổ sung nước cất và lắc với tốc độ 50 vòng/phút trong 5 phút, sau đó ly tâm lần 2 ở tốc độ 1.500 vịng/phút trong 10 phút. Sau đó, gạn bỏ phần dịch nổi, thu phần cặn trắng đục, rồi tiếp tục bổ sung dung dịch SDS 0,1% mới, lắc với tốc độ 50 vịng/phút trong 5 phút, sau đó ly tâm lần 3 với tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút. Tiếp tục bỏ phần dịch nổi, thu phần cặn lắng, bổ sung nước cất và lắc với tốc độ 50 vịng/phút trong 5 phút, sau đó ly tâm lần 4 ở tốc độ 1.500 vịng/phút trong 10 phút. Sau đó loại bỏ phần dịch nổi và thu hồi phần cặn màu trắng đục là thể vùi NPV sâu khoang đã được làm sạch.
Để các thể vùi NPV dễ dàng tách rời khơng bị vón cục khi lấy mẫu đếm số lượng thể vùi, cần phải tiến hành thêm bước bổ sung dung dịch Tryphto broth 1%, lắc trong 10 phút, rồi ly tâm ở 1000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó, bỏ phần dịch nổi thu phần cặn lắng, bổ sung nước cất, lắc với tốc độ 50 vòng/phút trong 5 phút và ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút. Sau ly tâm, thu phần cặn lắng thể vùi màu trắng đục cho vào ống bảo quản loại 2ml để riêng rẽ cho từng các thể sâu bị bệnh.
47
Việc phân lập NPV được tiến hành theo phương pháp của Grzywacz et al.
(1996) [12]. Sau khi phân lập được nguồn NPV trên các mẫu sâu chết thu được ngoài đồng ruộng, tiến hành lây nhiễm riêng rẽ trở lại trên sâu khỏe được nuôi nhân ngay sau khi trứng nở bằng thức ăn sạch là lá bắp cải được trồng trong nhà lưới, không phun bất kỳ loại thuốc bảo vệ thực vật nào. Hàng ngày kiểm tra số sâu chết bệnh và thu các mẫu sâu chết NPV điển hình. Các mẫu sâu chết thu được hàng ngày cũng được để riêng trong từng ống nghiệm theo ngày và tiến hành xử lý thu hoạch thể vùi như đã nêu ở phần trên.
Các bước phân lập và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao được tiến hành lặp lại theo các bước thực hiện như nêu trên trong 3- 4 lần. Tại mỗi bước, tiến hành việc phân lập và làm thuần kết hợp đánh giá hiệu quả gây chết sâu khoang, tới khi xác định được chủng NPV có hoạt lực gây chết sâu cao, sinh thể vùi nhiều và tương đối ổn định qua các lần phân lập thì tiến hành lưu giữ làm thực liệu để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo và phát triển sinh khối NPV sau này.
Thí nghiệm ở các bước phân lập được tiến hành theo phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (2000) [109] với 5 công thức (CT). Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại thực hiện với 50 sâu non sâu khoang tuổi 2 đã được nuôi bằng lá bắp cải sạch. Cụ thể:
CT1: Nhiễm thể vùi tinh phân lập từ sâu chết bệnh trên bắp cải CT2: Nhiễm thể vùi tinh phân lập từ sâu chết bệnh trên lạc CT3: Nhiễm thể vùi tinh phân lập từ sâu chết bệnh trên khoai sọ
CT4: Nhiễm thể vùi tinh từ chủng NPV lưu giữ trong quĩ gen (QG.NPV). Là chủng NPV phân lập từ sâu non sâu khoang chết NPV trên bắp cải năm 2014, được bảo quản ở nhiệt độ -1980C trong chương trình lưu giữ trong bộ sưu tập quĩ gen vi sinh vật có ích và được bảo quản tại Viện Bảo vệ thực vật.
CT5: Đối chứng sâu không nhiễm NPV
Theo dõi tỷ lệ sâu chết và số lượng thể vùi của 10 sâu chết sau 3, 7 và 10 ngày lây nhiễm vi rút thu từ một cá thể sâu chết bệnh NPV ban đầu.
Đánh giá hiệu lực gây chết sâu của các chủng NPV sau khi được tuyển chọn:
Đánh giá hiệu lực gây chết sâu để từ đó lựa chọn chủng NPV có hoạt lực cao và khả năng sinh thể vùi lớn. Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nghiên
48
cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (2000) [109] trên sâu non sâu khoang sạch trong điều kiện phịng thí nghiệm, bằng cách phun dịch chứa thể vùi của các chủng NPV với số lượng thể vùi 1,5 x 108 OB/ml với liều lượng 5ml cho mỗi khay đựng lá thầu dầu, là loại cây thức ăn sâu khoang ưa thích nhất để sâu non có thể ăn được tối đa thể vùi NPV, đã được xử lý vô trùng bằng cồn 900 trong 5 phút.
Thí nghiệm được tiến hành với 4 công thức, gồm 3 công thức là 3 chủng NPV có nguồn gốc thu từ bắp cải, lạc và khoai sọ. Mỗi cơng thức (CT) thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại tiến hành với 100 sâu khoang khoẻ tuổi 3.
CT1: Nhiễm thể vùi tinh của chủng NPV có nguồn gốc trên bắp cải CT2: Nhiễm thể vùi tinh của chủng NPV có nguồn gốc trên lạc CT3: Nhiễm thể vùi tinh của chủng NPV có nguồn gốc trên khoai sọ CT4: Đối chứng phun nước lã (không nhiễm NPV)
Sau 3; 7 và 10 ngày xử lý đánh giá tỷ lệ sâu bị chết và đếm số lượng thể vùi tạo ra sau nhiễm NPV ở các cơng thức. Từ đó tính hiệu lực gây chết sâu khoang của các nguồn vi rút đã được lựa chọn và đánh giá hàm lượng thể vùi được hình thành.
Phương pháp xác định số lượng thể vùi:
Xác định số lượng thể vùi theo phương pháp của Grzywacz et al. (1996)
[12], bằng cách dùng micropipet lấy 1ml dịch thể vùi NPV sau phân lập, pha loãng 2- 3 lần bằng nước cất vơ trùng.
Sau đó, nhuộm màu bằng Tryphan Blue và đếm số thể vùi hiện diện trên buồng đếm hồng cầu Neubauer và chụp ảnh thể vùi dưới kính hiển vi soi nổi Zeiss (Đức) kết nối với màn hình máy tính ở độ phóng đại 600X, chụp ảnh thể hoạt động
(virion) của NPV trên kính hiển vi điện tử (TEM) tại Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương (Hà Nội) với độ phóng đại 25.000X. Đếm số thể vùi 3 lần rồi lấy số liệu trung bình. Số
lượng thể vùi được tính theo cơng thức: a × 400 × 10n
A = ----------------------× 10.000b b
Trong đó: A: Số lượng thể vùi có trong 1ml
a: Số lượng thể vùi trung bình đếm được trên 1 ơ nhỏ b: Số ơ đếm (16 x 25 ô = 400 ô nhỏ)
49