3.2.1.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang
• Xác định mơi trường thích hợp ni nhân tế bào
Theo Freshney (1987), môi trường nuôi nhân là yếu tố quan trọng nhất trong việc nuôi cấy nhân tế bào côn trùng, giúp cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của tế bào, yếu tố tăng trưởng và hoocmon kích thích tăng trưởng tế bào, cũng như việc điều chỉnh độ pH và áp suất thẩm thấu của môi trường [44].
Từ nguồn tế bào đã được nuôi nhân từ thực liệu ban đầu đã được chuẩn bị dưới dạng huyền phù phục vụ các thí nghiệm. Một thí nghiệm đánh giá khả năng nhân sinh khối của tế bào sâu khoang trên các môi trường nuôi nhân khác nhau được tiến hành trong phịng thí nghiệm vào tháng 4/2015.
Kết quả nêu trong bảng 3.7 cho thấy ở tất cả 4 loại mơi trường nhân ni thì mật độ tế bào đạt được ở môi trường Excell 420- 14419C vào thời điểm sau 2 ngày nuôi nhân đạt cao nhất, tới 1,394 x 1010 tế bào/ml, cịn trên các loại mơi trường khác cho mật độ tế bào đạt từ 1,083- 1,130 x 1010 tế bào/ml. Tuy nhiên, qua phân tích thống kê thì mật độ tế bào thu được khơng có sự sai khác giữa 4 loại môi trường nuôi nhân.
Đến thời điểm 6 ngày sau ni nhân, qua đánh giá có 2 mơi trường cho sinh khối có mật độ tế bào cao là Excell 420-14419C, Schneider S9895 và TNM-FH T3285. Trong số đó, mơi trường Excell 420-14419C có mật độ tế bào hình thành cao nhất tới 1,884 x 1010 tế bào/ml. Tiếp đến là môi trường Schneider S9895 và TNM-FH T3285 với mật độ tế bào đạt tương ứng 1,606 x 1010 và 1,414 x 1010 tế bào/ml, cịn mơi trường TC-100 T3160 mật độ tế bào tăng rất ít so với thời điểm 2 ngày sau nuôi nhân (1,162 x 1010 tế bào/ml).
Kết quả thí nghiệm đã chứng tỏ mơi trường Excell 420-14419C thích hợp nhất đối với phát triển sinh khối tế bào sâu khoang. Mặc dù sau 10 ngày nhân nuôi ở môi trường này, mật độ tế bào hình thành có giảm, nhưng vẫn đạt tới mật độ 1,630 x 1010 tế bào/ml.
80
Cịn mơi trường Schneider S9895 và TC-100 T3160 có xu hướng duy trì khả năng phát triển sinh khối một cách khá ổn định. Sau 2 ngày nuôi nhân, mật độ tế bào đạt tương ứng là 1,130 x 1010 và 1,127 x 1010 tế bào/ml. Sau 6 ngày nhân nuôi, mật độ tế bào đạt tương ứng là 1,606 x 1010 và 1,414 x 1010 tế bào/ml
Bảng 3.7. Mật độ tế bào sâu khoang ở các ngày sau nuôi nhân trên các môi trường khác nhau
STT Môi trường nuôi nhân
Mật độ tế bào sâu khoang (x 1010 tế bào/ml) ở các ngày sau nuôi nhân
2 ngày 6 ngày 10 ngày
1 Excell 420- 14419C 1,394 a 1,884 a 1,630 a 2 Schneider S9895 1,130 a 1,606 b 1,171 a 3 TNM-FH T3285 1,083 a 1,414 ab 1,131 a 4 TC-100 T3160 1,127 a 1,162 b 1,152 a CV (%) 3,690 4,922 2,570 LSD0,05 0,251 0,546 0,287
Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05
Đến 10 ngày sau nuôi nhân, ở môi trường Excell 420-14419C mật độ tế bào vẫn đạt tới 1,630 x 1010 tế bào/ml, cịn Schneider S9895 vẫn duy trì 1,171 x 1010 tế bào/ml, với môi trường TNM-FH T3285 đạt mật độ 1,131 x 1010 tế bào/ml và ở môi trường TC-100 T3160 vẫn đạt tới 1,152 x 1010 tế bào/ml và (Bảng 3.7).
Hình 3.5: Thí nghiệm xác định mơi trường ni nhân tế bào thích hợp A: Ban đầu; B: Sau nuôi nhân 3 ngày
81
Từ kết quả thí nghiệm, có thể khẳng định môi trường Excell 420-14419C thích hợp nhất để ni nhân tế bào sâu khoang và thu hoạch tế bào tốt nhất vào thời điểm sau 6 ngày nhân nuôi. Mặc dù tế bào sâu khoang vẫn phát triển sinh khối trong môi trường Schneider S9895, TNM-FH T3285, TC-100 T3160 và đạt từ 1,162- 1,606 x 1010 tế bào/ml, nhưng giá mua các loại môi trường này cũng gần bằng giá mua Excell 420-14419C. Do vậy, nên sử dụng môi trường Excell 420-14419C để nhân sinh khối tế bào sẽ cho hiệu quả cao.
• Xác định nhiệt độ thích hợp ni nhân tế bào
Theo Lynn et al. (2005) [56], nhiệt độ thích hợp để ni nhân tế bào của
nhiều lồi cơn trùng trong khoảng 26- 280C và đó cũng là khoảng nhiệt độ thích hợp đối với nhiều lồi cơn trùng sinh sống trong tự nhiên. Kết quả các nghiên cứu đã cơng bố thì việc ni nhân tế bào cơn trùng thích hợp ở nhiệt độ 27- 280C giúp cho sự tăng trưởng sinh khối đạt mức tối ưu, chúng phát triển chậm hơn ở nhiệt độ thấp < 270C hoặc cao hơn 300C. Trên 300C, khả năng sống sót của tế bào cơn trùng giảm đáng kể và các tế bào không thể phục hồi việc phân chia ngay cả khi đưa nhiệt độ về lại 280C [10, 44, 45, 46, 50, 53, ...]. Trên cơ sở đó, thí nghiệm tìm hiểu nhiệt độ thích hợp nhân sinh khối sâu khoang được tiến hành với 4 mức nhiệt độ nuôi nhân khác nhau trong khoảng từ 24- 290C.
Kết quả trình bày ở bảng 3.8 cho thấy với mật độ tế bào ban đầu đưa vào thí nghiệm là 0,5 x 1010 tế bào/ml được nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 240C đến 290C thì sau 2 ngày nhân ni mật độ tế bào đạt từ 0,628 – 1,496 x 1010 tế bào/ml. Tại nhiệt độ 26 và 280C, mật độ tế bào đạt cao nhất tới 1,496 và 1,463 x 1010 tế bào/ml (tương ứng). Đến thời điểm sau 4 ngày nhân ni, mật độ tế bào lại có biểu hiện giảm đi, tương ứng với mức nhiêt độ 24 và 260C là 0,576 và 0,944 x 1010 tế bào/ml và ở nhiệt độ 290C cũng chỉ đạt 0,78 x 1010 tế bào/ml, riêng ở nhiệt độ 280C vẫn đạt mức cao 1,165 x 1010 tế bào/ml.
Sau 6 ngày nhân nuôi, hàm lượng tế bào tăng lên và đạt cao nhất trong số các ngày theo dõi ở tất cả các công thức nhiệt độ, đạt tới 2,141 x 1010 tế bào/ml ở nhiệt độ 240C và 2,341 x 1010 tế bào/ml ở nhiệt độ 290C. Trong số đó, ở nhiệt độ 260C đạt
82
2,954 x 1010 tế bào/ml. Riêng công thức nhiệt độ 280C, mật độ tế bào vẫn đạt mức cao nhất, tới 3,708 x 1010 tế bào/ml.
Đến thời điểm sau 8 ngày nhân nuôi, mật độ tế bào trong sinh khối đều giảm, ở nhiệt độ 240C mật độ tế bào còn 1,645 x 1010 tế bào/ml và ở nhiệt độ 290C mật độ tế bào chỉ đạt 1,80 x 1010 tế bào/ml. Trong khi đó, ở mức nhiệt độ 260C đạt 2,258 x 1010 tế bào/ml, nhưng ở 280C mật độ tế bào vẫn duy trì ở mức cao tới 2,325 x 1010 tế bào/ml (tương ứng).
Bảng 3.8. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ (0C)
Mật độ tế bào (x 1010 tế bào/ml) ở các ngày sau nuôi nhân nuôi
Ban đầu 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày
24 0,5 0,628 b 0,576 c 2,141 b 1,645 b 26 0,5 1,463 a 0,944 b 2,954 ab 2,258 a 28 0,5 1,496 a 1,165 a 3,708 a 2,325 a 29 0,5 1,039 ab 0,780 bc 2,341 b 1,800 b CV (%) 6,510 4,728 2,593 2,767 LSD0,05 0,895 0,938 1,430 0,829
Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05
Hình 3.6. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau. A: 240C; B: 260C, C: 280C và D: 290C
Như vậy, khi nhân nuôi tế bào ở nhiệt độ 280C mật độ tế bào đạt cao nhất tới 3,708 x 1010 tế bào/ml sau 6 ngày. Đến 8 ngày sau nhân ni, hàm lượng tế bào tuy có giảm đi song vẫn đạt tới 2,325 x 1010 tế bào/ml. Điều đó cho thấy nhiệt độ 280C
83
là nhiệt độ phù hợp cho việc nhân nuôi tế bào sâu khoang và sinh khối tế bào đạt cao nhất sau 6 ngày nhân nuôi. Kết quả thực hiện cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả đã nêu trên.
• Điều kiện pH mơi trường thích hợp nhân ni tế bào
Theo Lynn (2002) [30] thì q trình phát triển sinh khối của tế bào cơn trùng còn bị ảnh hưởng rõ rệt của pH môi trường nuôi nhân. Jakubowska et al. (2009)
khuyến cáo, pH của hemolymph côn trùng thường từ 6,4- 7,5, nên việc môi trường nuôi nhân tế bào cần giữ pH trong khoảng giá trị này.
Tìm hiểu điều kiện pH thích hợp đối với việc ni nhân tế bào sâu khoang, qua thí nghiệm được tiến hành với 6 mức pH của môi trường nuôi nhân khác nhau. Kết quả theo dõi sau 2 ngày nuôi nhân ở các mức pH là 6,0, 6,2 và 6,4, mật độ tế bào đạt được khá thấp, chỉ đạt tương ứng là 1,091, 1,329 và 1,12 x 1010 tế bào/ml và ở pH 6,6 và 7,0 mật độ đạt tương ứng 1,404 và 1,237 x 1010 tế bào/ml. Riêng ở điều kiện pH là 6,8 mật độ tế bào đạt cao nhất, tới 1,504 x 1010 tế bào/ml. (Bảng 3.9).
Đến 4 ngày sau nuôi nhân, mật độ tế bào thu được cũng khơng có sự thay đổi nhiều và có phần giảm đi chút ít, mật độ tế bào tương ứng với các mức pH 6,0, 6,2 và 6,4 là 1,008, 1,133 và 1,021 x 1010 tế bào/ml. Ở các mức pH 6,6 và 7,0 mật độtế bào trong sinh khối đạt 1,245 và 0,983 x 1010 tế bào/ml. Riêng ở pH môi trường là 6,8, mật độ tuy có giảm nhưng vẫn đạt mức cao nhất trong số các mức pH thí nghiệm, tới 1,312 x 1010 tế bào/ml.
Sau 6 ngày nhân nuôi, mật độ tế bào đạt mức cao nhất ở tất cả các mức pH trong các thời điểm sau nhân ni, nhưng có sự khác nhau rõ rệt giữa các cơng thức thí nghiệm. Khi nhân nuôi ở điều kiện pH là 6,0, 6,2 và 6,4 mật độ tế bào chỉ đạt 1,55, 1,591 và 1,233 x 1010 tế bào/ml (tương ứng). Tương ứng với điều kiện pH là 6,6 và 7,0 mật độ tế bào đạt 1,954 và 1,766 x 1010 tế bào/ml. Riêng công thức pH 6,8 mât độ tế bào vẫn đạt mức cao nhất trong số các cơng thức thí nghiệm, tới 2,125 x 1010 tế bào/ml (Bảng 3.9).
Vào thời điểm sau 8 ngày nuôi nhân, mật độ tế bào đều giảm rõ rệt so với mât độ tế bào ở thời điểm 6 ngày. Tương ứng với các mức pH là 6,0, 6,2 và 6,4 thì mật độ tế bào chỉ đạt 0,766, 0,633 và 0,883 x 1010 tế bào/ml, còn ở mức pH là 6,6 và 7,0
84
mật độ tế bào cũng chỉ đạt tương ứng là 1,125 và 0,867 x 1010 tế bào/ml. Riêng với điều kiện pH là 6,8 mật độ tế bào tuy giảm nhưng vẫn đạt mức cao nhất so với các mức pH còn lại, tới 1,241 x 1010 tế bào/ml (Bảng 3.9).
Bảng 3.9. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức pH môi trường khác nhau
Mức pH môi trường
Mật độ tế bào (x 1010 tế bào/ml) ở các ngày sau nhân nuôi Ban đầu 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 6,0 0,5 1,091 d 1,008 b 1,550 c 0,766 bc 6,2 0,5 1,120 d 1,012 b 1,233 d 0,633 c 6,4 0,5 1,329 bc 1,133 ab 1,591 c 0,883 b 6,6 0,5 1,404 ab 1,245 a 1,954 ab 1,125 a 6,8 0,5 1,504 a 1,312 a 2,125 a 1,241 a 7,0 0,5 1,237 bc 0,983 b 1,766 bc 0,867 b CV (%) 3,892 2,977 4,021 4,395 LSD0,05 0,324 0,386 0,318 0,297
Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05
Kết quả thí nghiệm đã cho thấy điều kiện pH thích hợp cho tế bào sâu khoang phát triển sinh khối là pH ở mức 6,8 và sinh khối tế bào đạt mật độ cao nhất cũng vào thời điểm 6 ngày sau nuôi nhân.
Mặt khác, cũng như kết quả thí nghiệm về mơi trường ni nhân nêu ở phần trên, mật độ tế bào trong sinh khối có biểu hiện xu thế giảm sau 4 ngày ni nhân, sau đó đạt đỉnh cao vào thời điểm sau 6 ngày rồi giảm mạnh sau 8 ngày nuôi nhân. Theo kết quả công bố của Grace (1982) và phân tích của Freshney (1987), sự giảm mật độ tế bào ở thời điểm sau 4 ngày là nhịp điệu phát triển bình thường của sinh khối tế bào, cịn biểu hiện giảm sau 8 ngày có liên quan đến sự thiếu hụt dinh dưỡng đáp ứng nhu cầu của sinh khối tế bào trong môi trường nuôi nhân [45, 44].
• Xác định tỷ lệ huyết thanh FBS bổ sung vào môi trường nhân tế bào
Theo Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2010) [72], huyết thanh là nhân tố cung cấp các chất dinh dưỡng tăng trưởng cần thiết cho chức năng tế bào, cung cấp
85
hormon và chứa các protein bám giúp vận chuyển các hormone, chất dinh dưỡng và tế bào chống tác hại của các chất thải trong quá trình nhân ni. Ngồi ra, huyết thanh còn chứa các nhân tố biệt hoá và chất ức chế enzyme Protease phân huỷ tế bào. Sudeep et al. (2005) [42] cho rằng FBS (Fetal Bovin Serum) là chất bổ sung
hiệu quả trong nuôi nhân tế bào cơn trùng, giúp tế bào duy trì sự tăng trưởng trong q trình nhân ni.
Thí nghiệm với 5 mức tỷ lệ FBS bổ sung vào môi trường ni nhân tế bào sâu khoang cho thấy nếu có bổ sung FBS vào môi trường nuôi nhân trong phạm vi từ 5- 25% thì sinh khối tế bào thu được đều có mật độ cao hơn so với đối chứng không bổ sung huyết thanh FBS (Bảng 3.10).
Khi nhân nuôi tế bào với các mức bổ sung FBS khác nhau, ở thời điểm 2 ngày sau nhân nuôi (NSNN), mật độ tế bào đều đạt từ 0,713- 0,937 x 1010 tế bào/ml. Riêng ở công thức bổ sung 25% FBS mật độ tăng nhanh nhất đạt tới 0,937 x 1010 tế bào/ml, trong khi đó, ở cơng thức đối chứng có mật độ tế bào thấp nhất, chỉ đạt 0,671 x 1010 tế bào/ml.
Đến 6 ngày sau nuôi nhân, tại tất cả các công thức bổ sung FBS đều đạt mật độ tế bào cao hơn so với đối chứng một cách rõ rệt, đạt từ 1,079- 2,165 x 1010 tế bào/ml, trong khi đối chứng chỉ đạt 0,655 x 1010 tế bào/ml.
Đến 10 ngày sau nuôi nhân, mật độ tế bào đạt mức cao nhất ở tất cả các công thức có bổ sung FBS. Mức đạt cao nhất tại công thức bổ sung 25% FBS, đạt tới 3,271 x 1010 tế bào/ml. Trong khi đó, bổ sung 5% FBS chỉ đạt mật độ 1,978 x 1010 tế bào/ml, cịn ở các cơng thức thí nghiệm với tỷ lệ FBS bổ sung từ 10, 15 và 20% FBS vào môi trường nuôi nhân tế bào qua xử lý thống kê thì khơng có sai khác nhau 1 cách có ý nghĩa (P≤ 0,05%) giữa các công thức này.
Như vậy, kết quả theo dõi sau 2, 6 và 10 ngày nuôi nhân cho thấy nếu bổ sung lượng FBS với tỷ lệ càng lớn thì tế bào vẫn tiếp tục phân chia phát triển sinh khối trong thời gian dài (tới 10 ngày sau nuôi nhân) và mật độ tế bào hình thành trong sinh khối càng cao. Tỷ lệ FBS bổ sung tới 25% FBS hàm lượng tế bào vẫn đạt cao nhất, tới 3,271 x 1010 tế bào/ml đến thời điểm sau 10 ngày nhân nuôi.
86
Bảng 3.10. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân trên mơi trường có bổ sung huyết thanh FBS với tỷ lệ khác nhau
Tỷ lệ FBS (%)
Mật độ tế bào (x 1010 tế bào/ml) ở các ngày sau nhân nuôi
Ban đầu 2 ngày 6 ngày 10 ngày
5 0,5 0,713 a 1,079 bc 1,978 b 10 0,5 0,736 a 1,365 b 2,473 bc 15 0,5 0,766 a 1,469 b 3,044 c 20 0,5 0,797 a 1,544 ab 3,183 c 25 0,5 0,937 b 2,165 a 3,271 d Khơng có FBS 0,5 0,671 a 0,655 c 0,505 a CV (%) 5,278 7,762 6,153 LSD0,05 0,289 0,335 0,454
Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05
Tuy nhiên, theo Weiss et al. (1981) [47], vẫn cần phải tiếp tục nghiên cứu cải tiến thay thế FBS bằng việc bổ sung thành phần bổ trợ khác nhằm giảm tỷ lệ bổ sung FBS. Vì khơng thể bổ sung FBS vào môi trường nuôi nhân với tỷ lệ cao tới 25% do giá mua FBS rất đắt, sẽ làm giá thành của sản xuất sinh khối tế bào tăng lên cao và hiệu quả kinh tế của việc sản xuất sinh khối tế bào giảm đi. Tác giả này cũng