• Xác định mật độ tế bào thích hợp
Nhằm tìm ra mật độ tế bào thích hợp cho lây nhiễm có hiệu quả để có thể thu hoạch thể vùi với số lượng cao. Kết quả thí nghiệm (Bảng 3.14) cho thấy sử dụng với cùng số lượng thể vùi 0,1 x 108 OB/ml để lây nhiễm, khi mật độ tế bào sâu khoang trong dịch nhiễm càng cao thì số thể vùi NPV hình thành thu hoạch được sau lây nhiễm càng nhiều.
Sau 1 ngày lây nhiễm, ở công thức lây nhiễm với mật độ tế bào là 1,0 và 2,0 x 108 tế bào/ml số lượng thể vùi đạt 1,08 và 1,21 x 108 OB/ml, cịn tại cơng thức có mật độ tế bào cao nhất 3,0 x 108 tế bào/ml thì số lượng thể vùi hình thành cũng đạt mức cao nhất, tới 1,68 x 108 OB/ml.
Tại thời điểm 3 ngày sau lây nhiễm (NSLN), khi nhiễm trên dịch có mật độ tế bào ở mức 1,0 và 2,0 x 108 tế bào/ml, số lượng thể vùi thu được tương ứng là 1,14 và 1,45 x 108 OB/ml. Trong khi đó, khi nhiễm trên dịch có mật độ tế bào 3,0 x 108 tế bào/ml thì số lượng thể vùi đạt tới 2,47 x 108 OB/ml.
Nhưng tới thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm thì số lượng thể vùi thu được ở cả 3 cơng thức thí nghiệm đều thấp hơn so với kết quả quan sát được ở cả 3 cơng thức thí nghiệm sau 3 ngày lây nhiễm. Tại công thức nhiễm virus trong dịch tế bào có mật độ 1,0 và 2,0 x 108 tế bào/ml số lượng thể vùi thu được sau 6 ngày lây nhiễm đạt 1,01 và 1,27 x 108 OB/ml (tương ứng). Cịn với cơng thức có mật độ tế bào 3,0 x 108 tế bào/ml, số thể vùi thu được vẫn cao nhất, đạt tới 2,43 x 108 OB/ml sau 6 ngày lây nhiễm (Bảng 3.14).
95
Bảng 3.14. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào có mật độ khác nhau
Công thức
Mật độ tế bào khi nhiễm (x 108 tế bào/ml)
Số thể vùi hình thành ở các ngày sau lây nhiễm (x 108 OB/ml)
1 ngày 3 ngày 6 ngày
1 1,0 1,08 b 1,14 b 1,01 b
2 2,0 1,21 b 1,45 b 1,27 b
3 3,0 1,68 a 2,47 a 2,43 a
CV (%) 0,635 1,441 1,524
LSD0,05 0,247 0,500 0,123
Ghi chú: tế bào/ml: tế bào trong 1 mililit; Trong cùng hàng, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05
Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy trong cả 3 cơng thức thí nghiệm với 1,0; 2,0 và 3,0 x 108 tế bào/ml, số lượng thể vùi hình thành cao nhất vào ngày thứ 3 sau lây nhiễm đạt1,14; 1,45 và 2,47 x 108 OB/ml (tương ứng).
Như vậy, khi nhiễm vi rút trên dịch có mật độ tế bào cao thì vi rút lây nhiễm sẽ hiệu quả hơn, vì trong quá trình lây nhiễm các thể hoạt động (virion) của virus có nhiều cơ hội tiếp cận với tế bào sâu khoang trong khi vẫn còn một phần đáng kể tế bào vẫn tiếp tục phân chia phát triển số lượng trong sinh khối. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu và nhận xét của Petchprakob et al., (2007) và Phejun
(2003) đã cơng bố [59, 117].
• Xác định nồng độ virus thích hợp
Theo Lynn (2002), mức độ tối ưu của việc lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào tuỳ thuộc vào 2 yếu tố là chỉ số MOI (là tỷ lệ giữa số lượng thể vùi NPV và số lượng tế bào khi lây nhiễm) và thời gian ủ lây nhiễm, theo tác giả, hầu hết các dịng tế bào cơn trùng thích hợp lây nhiễm virus theo chỉ số MOI từ 0,1- 0,5 [30].
Tìm hiểu khả năng lây nhiễm, tạo thể vùi của NPV trên tế bào sâu khoang dựa theo chỉ số MOI khác nhau, nhằm tìm ra số lượng thể vùi lây nhiễm thích hợp nhất. Kết quả được trình bày ở bảng 3.15 cho thấy với cùng
96
mật độ tế bào sử dụng cho lây nhiễm là 1,0 x 108 tế bào/ml, khi nhiễm với chỉ số MOI càng cao tức là số thể vùi đưa lây nhiễm càng lớn thì số thể vùi hình thành càng nhiều. Tại thời điểm sau 1 ngày khi nhiễm theo chỉ số MOI= 0,5, số thể vùi hình thành đạt tới 0,97 x 108 OB/ml. Trong khi đó, với chỉ số MOI là 0,1 và 0,3 chỉ đạt 0,62 và 0,78 x 108 OB/ml (tương ứng).
Tuy nhiên, đến thời điểm 3 ngày sau lây nhiễm tại công thức áp dụng chỉ số MOI là 0,1 và 0,3 cho hàm lượng thể vùi hình thành đạt tương ứng là 1,47, cao hơn hẳn so với chỉ số MOI khi lây nhiễm 0,5. Cịn tại cơng thức lây nhiễm với chỉ số MOI 0,3 số lượng thể vùi hình thành 1,29 x 108 OB/ml, tương tự như áp dụng chỉ số MOI 0,5.
Trong khi đó, hàm lượng thể vùi thu được của công thức lây nhiễm theo chỉ số MOI 0,5 chỉ đạt 1,21 x 108 OB/ml và khơng có sự sai khác với cơng thức nhiễm theo chỉ số MOI 0,3 tại cùng thời điểm 3 ngày sau lây nhiễm.
Bảng 3.15. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào theo chỉ số MOI khác nhau
Công thức
Chỉ số MOI khi lây nhiễm
Số lượng thể vùi hình thành ở các ngày sau lây nhiễm (x 108 OB/ml)
1 ngày 3 ngày 6 ngày
1 0,1 0,62 c 1,47 a 1,08 a
2 0,3 0,78 b 1,29 b 0,53 b
3 0,5 0,97 a 1,21 b 0,37 c
CV (%) 4,381 3,184 6,311
LSD0,05 0,224 0,636 0,208
Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa với độ tin cậy P ≤ 0,05
Nhưng đến thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm, qua theo dõi nhận thấy hàm lượng thể vùi hình thành bị giảm đi rõ rệt ở tất cả các cơng thức có chỉ số lây nhiễm MOI khác nhau, tương ứng với 3 chỉ số MOI 0,1; 0,3 và 0,5 số lượng thể vùi hình thành là 1,08, 0,53 và 0,37 x 108 OB/ml. Điều này cũng có thể do hệ quả của quá trình làm tăng độ pH trong môi trường dịch nhiễm, qua theo dõi
97
pH đã lên tới 8,5 sau 6 ngày lây nhiễm. Có thể do pH tăng (tới 9,0) đã phá vỡ một bộ phận thể vùi (Occlusion Bodies - OB) để giải phóng các thể vi rút hoạt động (virions) hoặc các virion khơng kết tụ để hình thành thể vùi như đã chỉ rõ qua nghiên cứu của Kanokwan et al. (2003) [79] và Lynn (2003) [85]. Vì vậy, số lượng thể vùi quan sát bị giảm so với lần quan sát vào 3 ngày sau lây nhiễm.
So sánh giữa 3 công thức lây nhiễm với chỉ số MOI khác nhau, thì lây nhiễm với chỉ số MOI là 0,1 được xác định là thích hợp nhất và cho số lượng thể vùi cao nhất ở cả hai thời điểm 3 ngày hoặc 6 ngày sau lây nhiễm, đạt số lượng thể vùi tương ứng đạt 1,47 và 1,08 x 108 OB/ml, mặc dù ở thời điểm 1 ngày sau lây nhiễm số lượng thể vùi hình thành 0,62 x 108 OB/ml. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả thí nghiệm về số lượng tế bào lây nhiễm như đã nêu ở phần trên, là khi lây nhiễm ở mật độ tế bào càng cao thì số lượng thể vùi hình thành càng nhiều.
• Xác định thời gian ủ lây nhiễm virus thích hợp
Các kết quả nêu trên cho thấy việc xác định thời gian ủ thích hợp là vấn đề cần thiết nhằm thu được số lượng thể vùi cao nhất trong mỗi đợt lây nhiễm sản xuất sinh khối NPV. Vì vậy, một thí nghiệm nhằm tìm hiểu thời gian ủ thích hợp để có thể thu hoạch số lượng thể vùi cao sau khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang (S. litura) nhân nuôi theo chỉ số MOI là 0,1 trên sinh khối tế bào có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml đã được tiến hành.
Kết quả thí nghiệm nêu trong bảng 3.16 cho thấy khi nhiễm virus thì số lượng thể vùi hình thành sau 1 ngày lây nhiễm đạt 0,72 x 108 OB/ml, sau 3 ngày số thể vùi đạt cao nhất, tới 1,53 x 108 OB/ml. Nhưng sau đó số lượng thể vùi hình thành lại giảm dần, còn 1,13 x 108 OB/ml vào thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm và chỉ còn 0,95 x 108 OB/ml sau 10 ngày lây nhiễm.
Theo Lynn (2002) [30], thời gian ủ lây nhiễm virus trên tế bào của nhiều lồi cơn trùng trong thời gian 3- 4 ngày, còn Knudson và Tinsley (1974) xác định thời gian tối ưu là 3 ngày khi lây nhiễm NPV đối với tế bào sâu Spodoptera frugiperda
[58]. Từ kết quả thí nghiệm nhận thấy, đối với tế bào sâu khoang (S. litura) thời gian ủ lây nhiễm NPV thích hợp để thu hoạch thể vùi vào thời điểm 3 ngày sau lây
98
nhiễm. Kết quả thí nghiệm này cũng tương tự như kết quả thí nghiệm đã cơng bố của Knudson và Tinsley (1974) trên tế bào sâu Spodoptera frugiperda [58].
Bảng 3.16. Số lượng thể vùi hình thành sau thời gian ủ lây nhiễm NPV khác nhau
Cơng thức thí nghiệm
Thời gian ủ lây nhiễm (ngày)
Số thể vùi hình thành (x 108 OB/ml) 1 1 0,72 b 2 3 1,53 a 3 6 1,13 c 4 10 0,95 d CV (%) 1,612 LSD 0,411
Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05
• Xác định mơi trường thích hợp cho lây nhiễm
Mclntosh et al., (2003) chỉ rõ để quá trình lây nhiễm của NPV trên tế bào côn trùng thành cơng thì mơi trường ni nhân có ý nghĩa hết sức quan trọng, vừa phải đảm bảo duy trì các hoạt động sống của tế bào, vừa tạo thuận lợi cho quá trình xâm nhập của các thể hoạt động (virion) của virus vào tế bào cơn trùng [74].
Tìm hiểu vấn đề này, tiến hành thí nghiệm trong năm 2017 với 4 loại môi trường khác nhau với với dịch tế bào sâu khoang có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml và lây nhiễm virus theo chỉ số MOI là 0,1 với môi trường pH 7,0 và nhiệt độ 280C.
Kết quả đánh giá được trình bày ở bảng 3.17 chỉ ra tại thời điểm 1 ngày sau nhiễm virus, với mơi trường Excell 420-14419C có số lượng thể vùi hình thành cao nhất tới 1,316 x 108 OB/ml, với môi trường Schneider S9895 đạt 1,142 x 108 OB/ml. Còn khi nhiễm virus trên tế bào với 2 loại môi trường TC-100- T3160 và IPL-41, số thể vùi hình thành đều đạt ở mức thấp, chỉ đạt 0,980 và 0,925 x 108 OB/ml (tương ứng).
Sau 3 ngày lây nhiễm, số lượng thể vùi hình thành đều cao hơn hẳn so với thời điểm sau nhiễm 1 ngày. Tại công thức sử dụng môi trường Excell 420-
99
14419C cho số lượng thể vùi hình thành vẫn đạt cao nhất tới 2,014 x 108 OB/ml, với môi trường Schneider S9895 đạt 1,835 x 108 OB/ml, trên môi trường TC-100- T3160 đạt 1,422 x 108 OB/ml và đạt số thể vùi thấp nhất khi lây nhiễm trên môi trường IPL-41 chỉ đạt 1,341 x 108 OB/ml.
Bảng 3.17. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang với các loại môi trường khác nhau
STT Môi trường lây nhiễm virus
Số lượng thể vùi sau các ngày lây nhiễm (x 108 OB/ml)
Sau 1 ngày Sau 3 ngày Sau 6 ngày
1 Excell 420-14419C 1,316 a 2,014 a 1,290 a 2 Schneider S9895 1,142 b 1,835 b 0,205 b 3 TC 100- T3160 0,980 c 1,422 c 0,192 b 4 IPL- 41 0,925 c 1,341 c 0,192 b CV (%) 1,874 0,528 0,723 LSD0,05 0,204 0,215 0,134
Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05
Đến thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm, số thể vùi thu được ở tất cả các công thức sử dụng môi trường khác nhau đều giảm thấp, số lượng thể vùi hình thành cao nhất đạt được khi sử dụng môi trường Excell 420-14419C là 1,290 x 108 OB/ml, với môi trường Schneider S9895 đạt 0,205 x 108 OB/ml. Còn trong các môi trường lây nhiễm khác gồm TC-100- T3160 và IPL-41 đều chỉ đạt 0,192 x 108 OB/ml, nhưng qua phân tích thống kê giữa chúng khơng có sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P < 0,05 (Bảng 3.17).
Kết quả thí nghiệm cho thấy cao điểm thể vùi hình thành vào 3 ngày sau lây nhiễm ở tất cả các môi trường, điều này cũng phù hợp với kết quả thí nghiệm về thời gian ủ lây nhiễm. Điều đó cũng chứng tỏ sử dụng mơi trường Excell 420- 14419C thích hợp và sẽ cho hiệu quả nhân sinh khối NPV cao hơn so với việc sử dụng các môi trường khác khi lây nhiễm virus trên tế bào sâu khoang.
100
• Xác định nhiệt độ thích hợp cho lây nhiễm
Thí nghiệm lây nhiễm trên mơi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 15% FBS và pH= 7,0 với dịch tế bào mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml. Lây nhiễm virus theo chỉ số MOI 0,1 với số lượng thể vùi NPV ban đầu là 0,1 x 108 OB/ml. Thí nghiệm lây nhiễm NPV được thực hiện ở 3 mức nhiệt độ khác nhau trong các tủ định ôn.
Kết quả trình bày trong bảng 3.18 cho thấy sau 1 ngày lây nhiễm ở nhiệt độ 26 ± 0,50C, số lượng thể vùi đạt 1,08 x 108 OB/ml, ở nhiệt độ 28 ± 0,50C đạt 1,15 x 108 OB/ml và số lượng thể vùi đạt tới 1,31 x 108 OB/ml ở 30 ± 0,50C.
Tuy nhiên, đến thời điểm 3 ngày sau lây nhiễm, số lượng thể vùi hình thành đều tăng cao tại tất cả 3 cơng thức nhiệt độ, trong đó số thể vùi đạt cao nhất lại ở cơng thức nhiệt độ 28 ± 0,50C tới 1,85 x 108 OB/ml, còn ở nhiệt độ 26 ± 0,50C và 30 ± 0,50C số lượng thể vùi có tăng nhưng ở mức thấp hơn so với ở nhiệt độ 28 ± 0,50C và đạt số thể vùi tương ứng là 1,37 x 108 và 1,58 x 108 OB/ml. Tuy nhiên, khi xử lý thống kê thì số lượng thể vùi thu được ở điều kiện nhiệt độ ủ lây nhiễm 28 ± 0,50C và 30 ± 0,50C khơng có sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05 (Bảng 3.18).
Bảng 3.18. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang ở nhiệt độ khác nhau
Công thức
Nhiệt độ khi lây nhiễm (0C)
Số lượng thể vùi ở các ngày sau lây nhiễm (x 108 OB/ml)
Sau 1 ngày Sau 3 ngày Sau 6 ngày
1 26 ± 0,5 1,08 a 1,37 a 0,692 a
2 28 ± 0,5 1,15 b 1,85 b 0,714 b
3 30 ± 0,5 1,31 b 1,58 b 0,687 a
CV (%) 1,508 1,612 0,861
LSD0,05 0,385 0,411 0,153
Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05
Đến thời điểm 6 sau lây nhiễm, số lượng thể vùi hình thành đều giảm ở cả 3 mức nhiệt độ thí nghiệm, nhưng ở nhiệt độ 28 ± 0,50C vẫn đạt mức cao nhất tới 0,714
101
x 108 OB/ml, cịn ở 2 cơng thức nhiệt độ 26 ± 0,5 và 30 ± 0,50C số lượng thể vùi giảm tới 50% chỉ còn tương ứng là 0,692 và 0,687 x 108 OB/ml. Có thể ở 2 mức nhiệt độ này đã ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm của NPV bị giảm (Bảng 3.18).
Kết quả thí nghiệm thu được cũng phù hợp với kết quả về thời gian đạt đỉnh cao số lượng thể vùi hình thành là 3 ngày sau nhiễm, như công bố của Knudson et
al. (1974) [58] khi nhiễm NPV trên tế bào sâu keo mùa thu (Spodoptera frugiperda)
với chỉ số MOI là 0,1 ở nhiệt độ 270C, sau 3 ngày sẽ đạt 100% số tế bào bị nhiễm virus, nhưng ở nhiệt độ 17 và 370C làm số lượng tế bào giảm nhanh và tỷ lệ tế bào nhiễm virus rất thấp.
• Xác định pH mơi trường thích hợp cho lây nhiễm
Theo kết quả nghiên cứu đã công bố của nhiều tác giả cho thấy pH mơi trường khi lây nhiễm hình thành thể vùi của NPV có vai trị hết sức quan trọng. Theo Jakubowska et al., (2009) [69], pH môi trường có tác động rất lớn đến khả
năng lây nhiễm của virus NPV trên tế bào cơn trùng và khả năng hình thành thể vùi bị ảnh hưởng rõ rệt khi lây nhiễm virus trong mơi trường có pH cao, thậm chí số lượng thể vùi bị giảm đáng kể do vỏ protein của thể vùi hiện có bị phá huỷ giải phóng ra các thể virus hoạt động (virion). Tác giả này cũng chỉ rõ yêu cầu về pH thích hợp cho lây nhiễm rất khác nhau tùy theo dòng tế bào của từng lồi cơn trùng.
Đánh giá khả năng hình thành thể vùi của NPV sâu khoang khi lây nhiễm ở