Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 50 Sau khi tiến hành phản ứng RT-PCR xác ựịnh chắnh xác virus gây bệnh, tiến hành tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR bằng Kit (ựã nêu trong phần phương pháp nghiên cứu) ựể loại bỏ hết các thành phần dư thừa sau phản ứng.
Sản phẩm sau khi tinh sạch là DNA của virus sẽ ựược Cloning với từng loại mồi (mồi xuôi và mồi ngược) ựể nhân nhanh số lượng bản sao theo một chiều của ựoạn gen (thực hiện phản ứng PCR-giải trình tự).
Tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự bằng Kit, sau ựó tiến hành giải trình tự ựoạn gen ựã ựược khuếch ựại một chiềụ
Quá trình giải trình tự ựược thực hiện bằng máy giải trình tự tự ựộng Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) tại Phòng thắ nghiệm trọng ựiểm Công nghệ sinh học Thú Ỵ
Kết quả ựược biểu thị bằng chương trình Genetyx thể hiện ở hình 3.5, hình 3.6:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 51 Hình 3.5 cho thấy chất lượng giải trình tự tốt, mỗi ựỉnh của giản ựồ ựều xác nhận một loại nucleotide, các nucleotide khác nhau liên tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi ựược ựọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng. Trong ựó Adenin (A) cho màu ựỏ, Thymin (T) cho màu xanh nước biển, Guanine (G) cho màu xanh lá cây, Cytocine (C) cho màu ựen. Chuỗi nucleotide thu ựược khi giải trình tự ựược xử lý bằng các phần mềm phân tắch trên máy tắnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 52
Hình 3.6. Trình tự nucleotide của 05 chủng virus LMLM phân lập ựược
Ghi chú: (.) Sự sai khác về trình tự nucleotide (*) Sự giống nhau về trình tự nucleotide
Sau khi phân tắch chúng tôi thu ựược ựoạn gen của 05 chủng virus LMLM nghiên cứu dài 600bp. Như vậy quá trình thực hiện phản ứng RT- PCR và giải trình tự ựã ựược thực hiện thành công. Trình tự nucleotide của ựoạn gen dài 600bp của 05 chủng virus LMLM nghiên cứu ựã ựược xác ựịnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 53 Hình 3.6 cho thấy trình tự nucleotide của ựoạn gen nghiên cứu của cả 05 chủng virus LMLM phân lập ựược (FMD-pg1, FMD-pg2, FMD-pg3, FMD-pg4, FMD-pg5) ựều dài 600 bp. Trong ựó có những sự sai khác ở một số vị trắ nucleotide nhất ựịnh giữa các chủng virus nghiên cứu, nhưng có mức tương ựồng gen giữa các chủng rất cao từ 99,7% - 100%.
Có 03 vị trắ nucleotide thể hiện sự sai khác về trình tự gen giữa các chủng virus trên, cụ thể như sau:
+ Tại vị trắ nucleotide thứ 103: ở chủng virus FMD-pg5 (nucleotide C) khác so với ở 4 chủng còn lại (nucleotide T).
+ Tại vị trắ nucleotide thứ 190: ở 02 chủng virus FMD-pg1 và FMD- pg3 giống nhau (nucleotide T), khác so với ở 03 chủng còn lại (nucleotide C). + Tại vị trắ nucleotide thứ 563: ở chủng FMD-pg2 (nucleotide A) khác so với ở 04 chủng còn lại (nucleotide G).
Chủng FMD-pg1 có trình tự gen không có sự sai khác nào với chủng FMD-pg3; sai khác 02 vị trắ nu 190 & nu 563 so với chủng FMD-pg2, FMD-pg4; sai khác 02 vị trắ nu 103 & nu 190 so với chủng FMD-pg5.
Chủng FMD-pg2 có trình tự gen sai khác 02 vị trắ nu 190 & nu 563 so với chủng FMD-pg1, FMD-pg3; sai khác 02 vị trắ nu 103 & nu 563 so với chủng FMD-pg5; sai khác 01 vị trắ nu 190 với chủng FMD-pg4.
Chủng FMD-pg4 có trình tự gen sai khác 02 vị trắ nu 190 & nu 563 so với chủng FMD-pg1, FMD-pg3; sai khác 01 vị trắ nu 563 so với chủng FMD-pg2; sai khác 01 vị trắ nu 103 so với chủng FMD-pg5.
Chủng FMD-pg5 có trình tự gen sai khác 02 vị trắ nu 103 & nu 190 so với chủng FMD-pg1, FMD-pg3; sai khác 02 vị trắ nu 103 & nu 563 so với chủng FMD-pg2; sai khác 01 vị trắ nu 103 so với chủng FMD-pg4.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 54 Như vậy có 02 chủng FMD-pg1 và FMD-pg3 giống nhau hoàn toàn về trình tự gen thu ựược, có mức tương ựồng 100%; còn lại giữa các chủng ựều có mức tương ựồng gen rất cao từ 99,7% - 99,8%. điều này cho thấy virus LMLM gây bệnh trên ựịa bàn tỉnh Thái Bình phân lập ựược là cùng một type (type O) nhưng có sự sai khác ở một vài vị trắ trong trình tự nucleotide song không ựáng kể.