Tiến hành thu virus khi bệnh tắch tế bào ựạt 80-90% diện tắch ựáy bình; chọn ra 05 chủng virus ựã phân lập là FMD-pg1, FMD-pg2, FMD- pg3, FMD-pg4, FMD-pg5 từ các lợn 1, 2, 3, 4, 5 ựể tiến hành tách chiết RNA phục vụ cho việc ựịnh type bằng phản ứng RT-PCR và giải trình tự gen. Quá trình tách chiết RNA của virus từ môi trường tế bào nuôi cấy ựược thực hiện theo hướng dẫn của bộ Kit QIAgen.
RNA của virus thu ựược sau khi tách chiết sẽ ựược tiến hành ựịnh type bằng phản ứng RT-PCR với sự tham gia của enzym sao chép ngược và các cặp mồi ựặc hiệu cho từng type gây bệnh ở Việt Nam (Le Van Phan và cs, 2011) Trình tự mồi cho từng type ựược trình bày theo bảng 4.4:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 48
Bảng 3.4. Trình tự mồi sử dụng ựể ựịnh type virus LMLM
Stt Type Tên mồi Trình tự
độ dài của sản
phẩm PCR
FMD-
VP1R CAT GTC YTC YTG CAT CTG GTT
1 O
FMD-OF AGA TTT GTG AAA GTD ACA CCA
658bp
FMD-
VP1R CAT GTC YTC YTG CAT CTG GTT
2 A
FMD-AF CTT GCA CTC CCT TAC ACC GCG
427bp
FMD-
VP1R CAT GTC YTC YTG CAT CTG GTT 3 ASIA
1 FMD-As1F GCG STH RYY CAC ACA GGY CCG G
535bp
Phản ứng RT-PCR ựược thực hiện theo các bước ựã trình bày trong phần phương pháp nghiên cứụ Sản phẩm của phản ứng RT-PCR ựược ựiện di kiểm tra kết quả và chụp ảnh. Kết quả ựược thể hiện ở hình 4.4 và bảng 4.5:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 49
Ghi chú: Thang chuẩn DNA M 100bp, giếng 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng mẫu virus FMD-pg1, FMD-pg2, FMD-pg3, FMD-pg4, FMD-pg5. Giếng 6, 7, 8 là ựối
chứng dương của các type O, A, Asiạ Giếng 9 là ựối chứng âm.
Bảng 3.5. Kết quả ựịnh type virus LMLM
Type STT Virus O A Asia 1 1 FMD-pg1 + - - 2 FMD-pg2 + - - 3 FMD-pg3 + - - 4 FMD-pg4 + - - 5 FMD-pg5 + - - 6 đối chứng (+) type O + - - 7 đối chứng (+) type A - + -
8 đối chứng (+) type Asia - - +
9 đối chứng (-) - - -
Qua hình 3.4 cho ta thấy: 05 chủng virus phân lập từ 05 lợn mắc bệnh ựược chọn ựể nghiên cứu ựều cho kết quả dương tắnh với type Ọ Vạch DNA tương ứng vạch 658bp theo ựúng trình tự mồi type Ọ Như vậy chủng virus LMLM gây bệnh cho lợn trên ựịa bàn tỉnh Thái Bình ựầu năm 2012 là virus LMLM thuộc type O, không có gì khác so với những năm 2008 trở lại ựâỵ