Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác ựịnh vị trắ sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNẠ Giải trình tự bộ gen người, ựộng vật và vi sinh vật giúp chẩn ựoán bệnh tật và nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất, phục vụ lợi ắch con ngườị Có 3 nhóm phương pháp giải trình gen chủ yếu: Phương pháp Maxam và Gilbert, phương pháp Dideoxy (còn gọi là phương pháp Sanger) và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự ựộng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
Giải trình tự gen theo phương pháp Maxam và Gilbert:
Năm 1977 Alan Maxam và Walter Gilbert phát minh phương pháp giải trình tự theo phương pháp hóa học. Phương pháp này hầu như không ựược sử dụng ngày nay do ựộ chuẩn xác kém, cần phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót ựể chọn một kết quả gần ựúng nhất nhưng nó là tiền ựề cho các phương pháp giải trình tự khác.
Giải trình tự gen theo phương pháp Dideoxy
Xác ựịnh trình tự gen theo phương pháp dideoxy do Frederick Sanger, Smith và Coulson xuất hiện năm 1977 (còn gọi là phương pháp giải trình tự gen bằng enzym hay phương pháp Sanger) dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong cơ thể sinh vật. F.Sanger ựã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của thực khuẩn thể X174 kắ sinh vi khuẩn ẸColi (1977) là bộ gen ựầu tiên ựược xác ựịnh trình tự. Trong phương pháp này tác giả sử dụng các nhân tố kết thúc ựặc hiệu quá trình kéo dài DNA khi tổng hợp.
Giải trình tự gen bằng máy tự ựộng
Máy giải trình tự gen bán tự ựộng hoặc tự ựộng hoàn toàn ựược thiết kế trên nguyên tắc sử dụng đNTP do F.Sanger và cộng sự phát minh. Trong quá trình tổng hợp DNA có sử dụng các mồi và dNTP ựánh dấu huỳnh quang thay cho ựánh dấu phóng xạ, mỗi loại dNTP ựược ựánh dấu huỳnh quang khác nhau nên sẽ biểu thị các màu sắc khác nhaụ Máy thực hiện tổng hợp các mạch ựơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA, ựồng thời sử dụng các phần mềm tắnh toán trên máy tắnh ựể xử lý kết quả giúp kiểm soát ựược các sai sót ựảm bảo ựộ chắnh xác caọ
Các bước thực hiện:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
Bước 2: chuẩn bị các ựiều kiện cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA và thực hiện nhân DNA bằng thiết bị PCR.
Bước 3: nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự gen và chạy máỵ
Bước 4: phân tắch kết quả từ các dữ liệu do máy tắnh cung cấp, so sánh kết quả xác ựịnh trình tự ở cả 2 mạch ựơn mới, ựồng thời căn cứ vào ựồ thị ựể sửa các sai sót và chọn kết quả chắnh xác nhất.