Phân lập virus ựược tiến hành trên môi trường tế bào BHK21. Quá trình này yêu cầu 2 yếu tố:
+ Huyễn dịch bệnh phẩm chứa virus nghiên cứu ựể gây nhiễm và phân lập trên môi trường tế bào
+ Môi trường tế bào BHK21
Quá trình phân lập virus ựược tiến hành bao gồm 3 khâu sau:
- Lấy mẫu bệnh phẩm vào các ống eppendorf
- Nghiền mẫu và tiến hành ly tâm
- Lấy dịch bên trên ống gây nhiễm vào môi trường tế bào BHK21 ựã
ựược chuẩn bị từ trước
Các bước tiến hành cụ thể của phương pháp phân lập:
Bước 1: Chuẩn bị tế bào phân lập
Ớ Phục hồi tế bào BHK21
Giống gốc tế bào BHK21ựược bảo quản trong nitơ lỏng, giữ ở Phòng thắ nghiệm trọng ựiểm Công nghệ sinh học Thú ỵ Trước khi tiến hành cần chuẩn bị: 7 ml môi trường ựầy ựủ (1x DMEM 10% huyết thanh bào thai bê)
làm ấm trong tủ ấm 370C trong 30 phút trước khi bắt ựầu mở giống.
Thực hiện phục hồi tế bào theo các bước sau:
Giải ựông: lấy 1 ống tế bào BHK21 giống gốc ra khỏi Nitơ lỏng, ựặt
vào cốc nước sạch, ựể ở nhiệt ựộ phòng, quan sát ựến khi khối tế bào ựông chuyển màu (từ hồng ựậm sang hồng nhạt) khi ựó ựã tan ựông.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
Cân bằng môi trường: thêm 1 ml môi trường DMEM ựầy ựủ (ựã làm
ấm ở 370C) vào ống tế bào, chuyển huyễn dịch tế bào sang ống falcon 15 ml.
Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản: ly tâm 700 vòng/phút /5 phút, loại bỏ phần dung dịch ở trên (giữ lại cặn tế bào màu trắng).
Hòa tan cặn tế bào bằng môi trường nuôi cấy tế bào: thêm vào ống tế
bào 6ml môi trường ựầy ựủ, gõ nhẹ vào ựáy ống ựể hòa tan tế bàọ
Cấy tế bào vào chai nuôi: chuyển huyễn dịch tế bào (6 ml) vào chai
nuôi tế bào 25cm2 (sử dụng chai T25) ghi tế bào nuôi, ngày giờ nuôị
Theo dõi tế bào phát triển và thay môi trường nuôi cấy tế bào: nhẹ
nhàng ựặt chai nuôi cấy vào tủ ấm 370C 5% CO2. Hàng ngày quan sát tế bào phát triển ở ựáy chai trên kắnh hiển vi soi nổi (và thay ựổi môi trường 2 ngày/lần nếu cần thiết) cho ựến khi tế bào phủ kắn bề mặt ựáy chai nuôị
Ớ Nhân số lượng tế bào
Trước khi tiến hành thắ nghiệm, cần xác ựịnh số chai tế bào cần nhân, lượng môi trường ựầy ựủ và không ựầy ựủ, lượng PBS, trypsin, và cân bằng ở 370C.
Khi có 80-90% tế bào phủ kắn bề mặt ựáy chai nuôi, có thể tiến hành tách tế bào bám dắnh và cấy chuyển như sau:
Loại bỏ môi trường ựang nuôi: loại bỏ môi trường trong chai nuôi tế
bào (bằng kim, sử dụng máy hút chân không). Thêm vào chai nuôi PBS(-)
(không chứa Ca2+ hoặc Mg2+) 3ml PBS(-)/ chai T25.
Trypsin hóa tách tế bào: thêm 0,2 ml trypsin-EDTA, ủ vừa ựủ ựể làm
các tế bào tách khỏi ựáy bình (trong 3-15 phút, không ựược ựể tế bào trong trypsin quá thời gian cần thiết). Thêm 7 ml môi trường không ựầy ựủ (không có huyết thanh bào thai bò ựể dừng quá trình trypsin hóa), trộn ựều, chuyển sang ống ly tâm 15 ml.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Loại bỏ trypsin: ly tâm với tốc ựộ 700 vòng/phút /5 phút, loại bỏ phần dung dịch ở trên, giữ cặn tế bào màu trắng.
Cân bằng môi trường: rất nhẹ nhàng, hòa tan tế bào trong 6 ml môi
trường ựầy ựủ (dùng pipette 5 ml hoặc dùng quả bóp ựánh mạnh nhiều lần ựể tế bào tách rời nhau hoàn toàn).
Cấy chuyển tế bào: ựánh dấu chai nuôi tế bào mới (tên dòng tế bào,
ngày nuôi cấy, lần cấy chuyển). Pha loãng tế bào ựến 2x105 tế bào/ml trong
môi trường DMEM ựầy ựủ (có bổ sung kháng sinh, chất chống nấm và 10% huyết thanh bào thai bê), vừa ựủ thể tắch cần nuôi cấỵ Chia huyễn dịch tế bào vào các chai nuôi 6 ml/chai T25, 15 ml/chai T75).
Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển: giữ chai tế bào nuôi ở 370C/5%
CO2, theo dõi thường xuyên sự phát triển của tế bào bằng kắnh hiển vi soi
nổi, ựến khi tế bào mọc dày thành một lớp thì ựem gây nhiễm.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu phân lập
Mẫu nghi bệnh ựược ựồng nhất với dung dịch DMEM rồi ly tâm. Sau ựó, thu lại hỗn dịch ựể gây nhiễm vào tế bào BHK21 ựã chuẩn bị ở bước 1.
Bước 3: Gây nhiễm virus và quan sát kết quả
Từ các bình nuôi tế bào ựã chuẩn bị ở bước 1 hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100 ộl mẫu ựã chuẩn bị ở bước 2.
Hỗn dịch virus tế bào ựược ủ ở 370C với 5% CO2 trong 30 phút.
Loại bỏ huyễn dịch virus thừa, bổ sung 1,5 ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB (Tryptose Photsphate Broth) vào bình nuôi và ủ ở 370C với 5% CO2.
Theo dõi sự phát triển bệnh tắch tế bào hằng ngày bằng kắnh hiển vi soi nổi và tiến hành thu virus khi chúng phá hủy 80-90% tế bào gây nhiễm.