Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 RNA tổng số là toàn bộ RNA ựược tách chiết từ mẫu nghiên cứụ Muốn thu RNA thì cần loại bỏ DNA, vì nếu lẫn DNA trong hỗn hợp sẽ ảnh hưởng ựến hiệu quả RT-PCR. RNA tổng số này có thể bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt ựộng (RNA thông tin, RNA vận chuyển) của tế bào và virus.
Mục ựắch là thu nhận ựược RNA của hệ gen virus LMLM ựạt hàm lượng cao, ựảm bảo ựủ làm khuôn cho phản ứng RT-PCR.
Tuy nhiên, vì sử dụng cặp mồi ựặc hiệu cho virus khi thu nhận RNA tổng số làm khuôn nên dù lẫn các loại RNA khác thì vẫn thu ựược sản phẩm từ hệ gen virus.
Có 2 cách tách chiết: bằng hóa chất và bằng kit
Tách chiết RNA virus bằng hóa chất: là phương pháp dùng các hóa chất thắch hợp ựể có thể phân tách và lấy ra ựược thành phần RNA mong muốn. Các hóa chất ựó bao gồm Trizol, Chloroform, Isopropyl alcohol, DEPC-treated water. Sau ựây là các bước tiến hành:
Bước 1: lấy một lượng bệnh phẩm vừa ựủ. Nghiền mẫu bệnh phẩm bằng chày, cối vô trùng (ựã hấp ướt ở 1210C trong 30 phút và sấy khô). Hút 1000ộl dung dịch PBS vào nghiền cùng.
Bước 2: giải phóng RNA
- Hút 100ộl huyễn dịch tế bào virus vào 1000ộl Trizol trong ống
Eppendorf 1.5 ml, giữ 1 ml huyễn dịch virus-Trizol ở nhiệt ựộ phòng (220C) trong 5 phút.
- Thêm 200ộl Chloroform, lắc mạnh (15 giây) và giữ ở nhiệt ựộ phòng
trong 3 phút, sau ựó ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 40C.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
- Chuyển 300-400ộl dung dịch nổi ở pha ưa nước có chứa RNA sang
ống Eppendorf khác, thêm 500ộl Isopropyl alcohol lắc ựều ựể làm kết tủa RNẠ
- Giữ dung dịch ở nhiệt ựộ phòng trong 10 phút, sau ựó ly tâm 12.000
vòng/ phút trong 5 phút ở 40C.
Bước 4: rửa phần tủa
- Bỏ dịch trên, thu cặn RNẠ
- Thêm 1ml ethanol 75% vào cặn RNA thu ựược. Lắc bằng máy
Vortex trong 15 giây, sau ựó ly tâm 75.000 vòng/phút /5 phút ở 40C
Bước 5: tan tủa RNA và thu RNA
- Loại bỏ phần dịch phắa trên, làm khô cặn RNA bằng cách mở nắp ống Eppendorf chứa RNA, ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 10 phút.
- Thêm 20-50 ộl DEPC Ờ treated water vào ống Eppendort, hòa tan tủa
RNA bằng pipet.
- Ủ hỗn dịch RNA ở 600C/10 phút nếu cần thiết.
Tách chiết RNA virus bằng Kit QIAamp của hãng QIAgen: là phương pháp sử dụng Kit theo sự hướng dẫn của tài liệu ựi kèm. Chuẩn bị pha hỗn hợp buffer sau ựó tiến hành tách chiết RNA theo các bước sau:
Bước 1: hút 560 ộl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5 ml.
Bước 2: thêm 140 ộl dung dịch mẫu ựã xử lý (hỗn dịch chứa virus và dung dịch PBS cho vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm) vào ống Eppendorf trên, sau ựó lắc ựều nhanh trong 15 giây rồi ựể ở nhiệt ựộ phòng 10 phút.
Bước 3: thêm 560 ộl dung dịch Ethanol (96-100o), lắc ựều nhanh trong 15 giâỵ
Bước 4: chuyển 630 ộl huyễn dịch trên sang cột QIAamp spin. Ly tâm 8.000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ nước dướị
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Bước 5: lặp lại bước 4.
Bước 6: Thêm 750 ộl dung dịch AW1, ly tâm 8.000 vòng/phút, trong 1 phút rồi giữ cột, bỏ nước dướị
Bước 7: thêm 750 ộl dung dịch AW2, ly tâm 13.000 vòng/phút, trong 3 phút, giữ cột, bỏ nước dướị Sau ựó ly tâm lại thêm một lần nữa 13.000 vòng/phút, trong 1 phút.
Bước 8: chuyển cột sang một ống Eppendorf mớị Thêm 60 ộl dung dịch
AVE, ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 1 phút. Sau ựó ly tâm 8.000 vòng/phút, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dướị Dịch lỏng bên dưới chắnh là dung dịch chứa RNA tổng số.
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20oC hoặc -800C.