1.4.1. Loài vật mắc bệnh
Theo các tác giả Phan đình đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958), Nandy (1996) và nhiều tác giả khác thì bệnh LMLM là bệnh của loài ựộng vật móng guốc chẵn bao gồm cả vật nuôi và ựộng vật hoang dã: trâu, bò, dê, cừu, lợn, hươu, nai, voi, lạc ựà, sơn dương, nhắm, khỉẦChó mèo không mắc. Trong phòng thắ nghiệm có thể gây bệnh cho bê, chuột nhắt trắng, chuột lang, thỏ.
1.4.2. Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây
Ớ Chất chứa mầm bệnh
Virus có nhiều trong các bệnh tắch ựặc hiệu các mụn nước, dịch mụn nước, màng bọc mụn trên con vật mắc bệnh. độc lực của virus xuất hiện sớm nhất ở nước dãi (10 giờ sau khi nhiễm virus). Virus có nhiều nhất trong dịch mụn tiên phát và mới mọc (khoảng 2 ngày) và có ựộc lực mạnh. Virus có ở trong máu (khi sốt), nội tạng có bệnh tắch. Virus tồn tại trong nước dãi, nước tiểu, phân, sữa, nước mắt, nước mũi, nhiều nhất khi mụn ở miệng vỡ và có thể kéo dài ựến 11-13 ngàỵ Tường, nền, máng ăn, chất ựộn chuồng, rơm cỏ, các ựồ vật, dụng cụ chăn nuôi và chuồng nuôi súc vật bệnh ựều có thể chứa virus.
Ớ đường lây lan
Trực tiếp từ gia súc mắc bệnh, khi mầm bệnh theo thức ăn nước uống xâm nhập vào cơ thể qua ựường tiêu hóa hoặc qua tổn thương ở da, gián tiếp qua không khắ vào ựường hô hấp gây bệnh cho gia súc (Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2010).
Trong ổ dịch, con ựường truyền lây chủ yếu qua không khắ vào ựường hô hấp, tiếp theo là qua thức ăn, nước uống, chất thải, dụng cụ chăn
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 20 nuôi, người chăn nuôi và cán bộ thú y mang mầm bệnh truyền ựị Bệnh lây lan từ vùng này sang vùng khác qua con ựường tiêu thụ, vận chuyển súc vật sống và sản phẩm ựộng vật không ựược kiểm dịch chặt chẽ (theo Aphis, USDA).
Ớ đường xâm nhập
- Trong thiên nhiên: có thể xâm nhập trực tiếp qua nước bọt hoặc
gián tiếp qua không khắ, thức ăn, nước uống, chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi .... Bệnh lây chủ yếu qua ựường tiêu hóạ Ngoài ra, có thể lây qua ựường hô hấp, sinh dục, do ựộng vật chân ựốt truyền.
- Trong thắ nghiệm: ựường nội bì có hiệu quả nhất. Ngoài ra còn có
những ựường tiêm khác như: tiêm bắp, dưới da, tĩnh mạchẦ nhưng lại cho kết quả không chắc chắn và ựòi hỏi liều virus cao hơn.
1.4.3. Cơ chế sinh bệnh
Thời gian nung bệnh trung bình 2-4 ngày, ựôi khi kéo dài ựến 7 ngày, thậm chắ 11 ngày trong bệnh tự nhiên.
đầu tiên virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, qua thức ăn, nước uốngẦ hoặc các vết trầy ở bên ngoài cơ thể. Virus sẽ nhân lên tại các vị trắ xâm nhập ở lớp thượng bì của miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, da, tạo nên mụn nước sơ cấp, thường các mụn nước này ắt và ở giai ựoạn ựó thú vẫn sinh hoạt bình thường, do ựó dễ dàng bị bỏ qua không phát hiện ựược. Sau 1-2 ngày virus từ mụn nước sơ phát xâm nhập vào máu và phủ tạng, tạo nên triệu chứng sốt caọ Cuối giai ựoạn sốt, virus nhân lên gây mụn nước thứ phát ở xoang miệng, vành móng, kẽ móng, núm vú Ầ. Tuy nhiên, máu và phủ tạng không phải là nơi thắch hợp cho sự phát triển, do ựó virus quay ngược trở về các vị trắ trên cơ thể có vùng thượng bì non như môi, nướu răng, lưỡi, gờ móng, ựầu vú ựể phát
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 21 triển, tạo các mụn nước thứ cấp. đặc ựiểm mụn nước chỉ mọc ở phần thượng bì, không ăn sâu vào lớp trung bì và hạ bì, do ựó sau khi mụn nước vỡ sẽ rất mau lành lại, và ắt gây nhiễm trùng thành mụn mủ nếu ựược chăm sóc tốt. Virus có thể tạo các mụn nước ở khắ quản, phế quản hoặc tấn công vào cơ tim kéo theo sự phụ nhiễm của vi khuẩn Staphylococcus, tạo nên các thể viêm cơ tim, thoái hoá cơ tim làm gia súc chết ngạt.
1.5. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH BỆNH LMLM 1.5.1. Triệu chứng
Triệu chứng ựặc trưng của bệnh LMLM là: Ộlở mồmỢ và Ộlong móngỢ ựúng như tên gọi của bệnh. Các triệu chứng chắnh của bệnh bao gồm:
- Tăng thân nhiệt: sốt thành hai ựợt, ựợt một do virus LMLM, ựợt hai do nhiễm trùng thứ cấp. Bệnh hay gặp ở vùng nhiệt ựới, con vật ủ rũ, lông
dựng, da mũi khô, sốt cao 40-410C kéo dài 3 ngàỵ
- đi khập khiễng do xuất hiện các mụn nước và vết loét ở xung quanh gờ vành móng, khe ngón và ựế guốc. Nếu nặng thì què do long móng. Xuất hiện các mụn nước sau ựó vỡ loét ra ở xoang miệng, lưỡi, lợi và các vùng da mỏng như vú ....
- Con vật kém ăn hoặc không ăn do ựau khi nhai, chảy nước dãi nhiều hơn bình thường. Sau khi hàng loạt mụn nước vỡ dần sẽ dẫn ựến nhiễm trùng máu, nhiễm trùng da, thú sốt cao, suy nhược dần rồi chết.
Những biến chứng xảy ra khi ựiều kiện vệ sinh, chăm sóc kém làm mụn vỡ dẫn ựến nhiễm trùng, chân bị long móng, thối móng, thối xương làm thú què. Vú thì bị viêm tắt sữạ Các mụn khác vỡ sẽ gây nhiễm vi khuẩn kế phát, bại huyết rồi chết. Bệnh lở mồm long móng ghép với các
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 22 bệnh ký sinh trùng hay vi khuẩn khác có sẵn trong máu có thể làm con vật mau chóng chết.
Tổn thương ở miệng của lợn nhẹ hơn của trâu bò. Biểu hiện rõ nhất ở lợn là ựi lại khập khiễng do tổn thương nghiêm trọng ở các chi, ựặc biệt là lợn nuôi trên nền chuồng bê tông. Bệnh gây chết với tỷ lệ cao ở lợn con (Nguyễn Tiến Dũng, 2000).
1.5.2. Bệnh tắch
Ớ Bệnh tắch ựại thể
Bệnh tắch chủ yếu của bệnh LMLM là các mụn nước, vết loét, sẹo ở xoang miệng, vành móng, kẽ ngón, da vú... và hiện tượng lở mồm, long móng. Khi mổ ựộng vật, ta có thể gặp các bệnh tắch sau:
- Mặt ngoài của tim có các vết xuất huyết thành vệt như da hổ, gọi là Ộtim hổỢ (Nguyễn Tiến Dũng, 2000). Nếu con vật sống sót thì thấy tim bị giãn to và mềm nhũn. Trên vết cắt cơ tim xuất hiện vết sọc với những nốt vàng rải rác nổi rõ trên phần cơ tim bình thường (Cục Thú Y, 2003).
- Viêm khắ quản và viêm phổi; lách sưng to và ựốm sẫm; có mụn nước kèm theo tụ huyết, xuất huyết ở niêm mạc ựường tiêu hóa như lợi, mép chân răng, thực quản, dạ múi khế, ruột non....
Ớ Bệnh tắch vi thể:
Bệnh tắch vi thể có thể quan sát thấy ở bề mặt biểu mô, cơ tim và cơ bắp. đặc biệt là ở cơ tim của ựộng vật non có thể bị hoại tử kéo dài, kèm theo sự xâm nhiễm mạnh của các tế bào lymphọ đây là nguyên nhân phổ biến dẫn ựến tử vong ở gia súc non.
Bệnh tắch ở lớp thượng bì: tổn thương ở các tế bào biểu bì, thoái hóa ở các tế bào ở giữa lớp biểu bì. Bên trong tế bào bị thoái hóa, nguyên sinh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 23 chất bắt màu Eosin, nhân trong tế bào co lại và thẫm màụ Dịch thủy thũng có thể có fibrin. Lớp tế bào bì có sự thâm nhiễm bạch cầu ựa nhân trung tắnh. Có hiện tượng hoại tử tan và thấm nước phù.
Bệnh tắch ở cơ vân: hoại tử các sợi cơ tạo thành những nốt kết hợp với sự thâm nhiễm các tế bào viêm.
1.6. CHẨN đOÁN VÀ PHÒNG TRỊ 1.6.1. Các phương pháp chẩn ựoán
* Chẩn ựoán lâm sàng
để chẩn ựoán bệnh LMLM, ựầu tiên căn cứ vào các dấu hiệu lâm sàng của bệnh. Tuy nhiên, việc chẩn ựoán lâm sàng thường dễ bị nhầm lẫn với các bệnh khác như: bệnh viêm mụn nước (Vesicular stomatitis), bệnh mụn nước ở lợn (Swine vesicular disease), bệnh mụn nước ban ựỏ ở lợn (Vesicular exanthema of swine), bệnh dịch tả trâu, bò, bệnh tiêu chảy siêu trùng ở bò.... Do ựó ựể chẩn ựoán phân biệt chắnh xác phải dựa trên chẩn ựoán phòng thắ nghiệm.
* Chẩn ựoán virus học
Dùng huyễn dịch bệnh phẩm (mụn nước, biểu mô...) nuôi cấy trên tế bào mẫn cảm (tế bào thận bê, BHK21...), tiêm cho ựộng vật thắ nhiệm (chuột lang, bê...), tiêm nội bì lưỡi bò trưởng thành, rồi theo dõi sự biến ựổi của tế bào hoặc triệu chứng, bệnh tắch của ựộng vật thắ nghiệm, ựể xác ựịnh trong bệnh phẩm có chứa virus hay không.
* Chẩn ựoán huyết thanh học
Ớ Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT).
Phản ứng KHBT ựược thực hiện nhờ hệ thống dung huyết và hệ thống dung khuẩn với sự tham gia của bổ thể. Bởi vì, sự dung khuẩn mắt
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 24 thường không nhìn thấy ựược, do vậy phải dùng hệ thống dung huyết ựể ựánh giá kết quả qua quan sát bằng mắt thường (Nguyễn Bá Hiên và Trần Lan Hương, 2009).
Phản ứng KHBT ựơn giản, cho kết quả nhanh, chắnh xác và ắt tốn kém trong chẩn ựoán phân biệt giữa bệnh LMLM và các bệnh viêm mụn nước khác. Tuy nhiên dùng phản ứng KHBT ựể phân biệt các type virus LMLM với nhau kém hiệu quả.
Ớ Phản ứng trung hòa virus.
Trong chẩn ựoán bệnh LMLM, phản ứng trung hòa dùng kháng
nguyên chuẩn là 7 type virus LMLM sống, ở hiệu giá 100 TCID50, ựể xác
ựịnh kháng thể nghi là huyết thanh của con vật nghi mắc bệnh.
Phản ứng trung hòa thường rất nhạy và ựặc hiệu, chỉ cần 2-3 ngày là có kết quả. Tuy nhiên nếu lượng huyết thanh ắt, hiệu giá thấp thì dương tắnh giả có thể xảy rạ
Ớ Phản ứng ELISẠ
Nguyên lý: phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể
gắn enzym cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vàọ Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym không bị rửa trôi, enzym sẽ phân giải cơ chất tạo nên màu, khi so màu trong quang phổ kế sẽ ựịnh lượng ựược mức ựộ phản ứng (Nguyễn Như Thanh, 1974).
Ớ Phương pháp RT-PCR
Kỹ thuật PCR ựược Karry Mullis và cộng sự phát minh ra vào năm 1985. Kỹ thuật này tiếp tục ựược hoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành công các máy chu trình nhiệt cho
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 25 phép thay ựổi nhanh chóng và chắnh xác nhiệt ựộ cho từng giai ựoạn phản ứng. Kỹ thuật PCR ựược xem như một trong những phương pháp nền quan trọng của cộng nghệ sinh học hiện ựại (Nguyễn Quang Thạch, 2005).
đối với virus LMLM, trước khi tiến hành PCR thông thường, RNA của virus cần ựược chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptasẹ Phương pháp PCR như vậy thường ựược gọi là RT-PCR (Nunez và cs, 1998). RT-PCR ựược áp dụng rộng rãi trong chẩn ựoán nhanh và ựịnh type virus LMLM (Reid S.M và cs, 2000). Phương pháp ựặc biệt có ý nghĩa trong chẩn ựoán phân biệt bệnh LMLM và bệnh mụn nước do virus ở lợn (Loma Kina và cs, 2004).
1.6.2. Vacxin LMLM phòng bệnh.
Các biện pháp kiểm soát dịch bệnh bao gồm: các dịch vụ thú y mà nhà nước cung cấp như vacxin. Ước tắnh khoảng 2,6 tỷ liều vacxin lở mồm long móng ựược quản lý hàng năm (Hamond, 2011) cho các quốc gia vùng lãnh thổ trên thế giới phòng chống LMLM.
Còn ở nước ta chi phắ vacxin cho phòng chống hàng năm theo chương trình quốc gia khống chế bệnh LMLM cũng khá tốn kém:
+ Năm 2012: phân bổ theo chương trình quốc gia nói trên cho 25 tỉnh vùng khống chế và 17 tỉnh vùng ựệm với tổng kinh phắ hơn 30 tỷ ựồng. + đầu năm 2013: phân bổ cho 24 tỉnh vùng khống chế với 2,187 triệu liều; 19 tỉnh vùng ựệm với 1,04 triệu liều với tổng số kinh phắ là khoảng 32 tỷ ựồng.
Vacxin nước ta dùng trong chương trình quốc gia hiện nay chủ yếu là loại vacxin LMLM ựơn giá type O của hãng Merial do xắ nghiệp thuốc Thú y Trung ương (VETVACO) cung ứng. Vacxin chứa thành phần kháng nguyên có tác dụng làm giảm hoặc ức chế sự sao chép của virus LMLM.
Vacxin LMLM có 03 loại cơ bản là vacxin vô hoạt formol keo phèn, vacxin chế trên môi trường tế bào, vacxin ựược sản xuất theo công nghệ gen.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
1.6.3. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR ựược thực hiện dựa trên những nguyên tắc cơ bản của quá trình tổng hợp DNA trong cơ thể như: đoạn DNA cần nhân lên ựược mở xoắn chuyển thành 2 sợi ựơn làm khuôn; các ựoạn mồi gắn (mồi xuôi và mồi ngược) làm cơ sở cho sự kéo dài sợi mới; nguyên liệu dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzym DNA Polymerase và một số ựiều kiện cần thiết cho sự
tổng hợp như Mg2+; khác ở chỗ việc mở xoắn kép vốn ựược thực hiện nhờ
enzym Helicase nay ựược thay thế bằng xử lý nhiệt ựộ cao kết hợp cho từng giai ựoạn phản ứng với những giai ựoạn mồi ựược thiết kế hoàn toàn chủ ựộng, dẫn ựến sự tạo thành số lượng sản phẩm (ựoạn DNA ựược nhân) rất lớn trong khoảng thời gian thực hiện ngắn và phục vụ hiệu quả mục ựắch của con ngườị Phản ứng PCR là 1 chuỗi nhiều chu kỳ ựược lặp ựi lặp lại, mỗi chu kỳ gồm ba bước:
Bước 1: biến tắnh phân tử DNA (denaturation), DNA sợi kép ựược duỗi xoắn thành 2 sợi DNA mạch ựơn.
Bước 2: giai ựoạn lai (hybridiration) là giai ựoạn cho phép mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn
Bước 3: giai ựoạn tổng hợp nên sợi DNA mớị
1.6.4. Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác ựịnh vị trắ sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNẠ Giải trình tự bộ gen người, ựộng vật và vi sinh vật giúp chẩn ựoán bệnh tật và nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất, phục vụ lợi ắch con ngườị Có 3 nhóm phương pháp giải trình gen chủ yếu: Phương pháp Maxam và Gilbert, phương pháp Dideoxy (còn gọi là phương pháp Sanger) và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự ựộng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
Giải trình tự gen theo phương pháp Maxam và Gilbert:
Năm 1977 Alan Maxam và Walter Gilbert phát minh phương pháp giải trình tự theo phương pháp hóa học. Phương pháp này hầu như không ựược sử dụng ngày nay do ựộ chuẩn xác kém, cần phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót ựể chọn một kết quả gần ựúng nhất nhưng nó là tiền ựề cho các phương pháp giải trình tự khác.
Giải trình tự gen theo phương pháp Dideoxy
Xác ựịnh trình tự gen theo phương pháp dideoxy do Frederick Sanger, Smith và Coulson xuất hiện năm 1977 (còn gọi là phương pháp giải trình tự gen bằng enzym hay phương pháp Sanger) dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong cơ thể sinh vật. F.Sanger ựã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của thực khuẩn thể X174 kắ sinh vi khuẩn ẸColi (1977) là bộ gen ựầu tiên ựược xác ựịnh trình tự. Trong phương pháp này tác giả sử dụng các nhân tố kết thúc ựặc hiệu quá trình kéo dài DNA khi tổng hợp.
Giải trình tự gen bằng máy tự ựộng
Máy giải trình tự gen bán tự ựộng hoặc tự ựộng hoàn toàn ựược thiết kế trên nguyên tắc sử dụng đNTP do F.Sanger và cộng sự phát minh. Trong quá trình tổng hợp DNA có sử dụng các mồi và dNTP ựánh dấu huỳnh quang thay cho ựánh dấu phóng xạ, mỗi loại dNTP ựược ựánh dấu huỳnh quang khác nhau nên sẽ biểu thị các màu sắc khác nhaụ Máy thực hiện tổng hợp các mạch ựơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA, ựồng thời sử dụng các phần mềm tắnh toán trên máy tắnh ựể xử lý kết quả giúp kiểm soát ựược các sai sót ựảm bảo ựộ chắnh xác caọ
Các bước thực hiện: