CHƯƠNG 1 : ĐẶT VẤN ĐỀ
2.3 Phương pháp xác định hoạt tính chống Oxy hĩa
2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
Hiện nay ngày càng cĩ nhiều mối quan tâm về các chất chống oxy hĩa thứ cấp từ thực vật như là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy hĩa cĩ hại tồn tại sẵn cĩ trong cơ thể. Trong đời sống các sinh vật kỵ khí và hiếu khí đều thiết lập một sự cân bằng tinh tế giữa ích lợi và nguy cơ trong việc sử dụng oxy để đạt năng lượng. Trong quá trình hơ hấp chúng đã tạo ra các hợp chất trung gian là các gốc tự do: anion superoxide (O2), hydroxyl (OH), chất oxy hĩa như H2O2 cĩ hoạt tính phản ứng rất lớn, mà từ các chất này cũng như các sản phẩm phản ứng của chúng là nguyên nhân phá hủy các phân tử sinh học như DNA, lipid, protein… Mặc dù bản thân của sinh vật đã tự phát triển các hệ thống enzyme nhằm điều hịa các loại phân tử oxy hoạt tính cao này như superoxide dismutase, catalae, glutathione peroxidase là các enzyme điều hịa nhằm duy trì sự an tồn trong giới hạn cho phép của anion superoxide, H2O2 và các hydroperoxide hữu cơ tương ứng, chúng được xem là các enzyme khử độc chính trong cơ thể. Đơi khi hệ thống bảo vệ trên bị quá tải, khơng khí bị ơ nhiễm, khĩi thuốc lá, bức xạ tử ngoại…các loại oxy hoạt tính cao này vượt quágiới hạn cho phép sẽ là nguồn gây bệnh, thúc đẩy nhanh quá trình lão hĩa cho sinh vật. Các chất chống oxy hĩa từ thực vật đã gĩp phần hỗ trợ cho hệ thống bảo vệ của cơ thể, ngăn chặn oxy hĩa khơng mong muốn như các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…và các hợp chất trao đổi chất thứ cấp từ thực vật đã và đang được quan tâm nghiên cứu.
23
2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO
Trong hệ thống thần kinh trung ương và ngoại biên, vai trị của NO rất quan trọng: Đĩng vai trị dẫn truyền thần kinh, mang tín hiệu đến bất cứ nơi nào trong cơ thể, điều khiển cân bằng nội mơ mạch não, điều hịa cảm nhận đau, điều khiển quá trình tư duy và trí nhớ. NO được sinh ra từ NOS tổ chức (nNOS và eNOS) sẽ ảnh hưởng lên trường lực cơ bản của mạch não và gĩp phần điều hịa vận mạch khi bị kích thích. Vì vậy, sự rối loạn NO sẽ dẫn đến một số bệnh về não như bệnh: Alzeimer, thiếu máu não, đột quỵ. NO cĩ một vai trị vơ cùng quan trọng đối với cơ thể là tác nhân gĩp phần điều hịa huyết áp, ngồi ra NO cịn là yếu tố gây giãn mạch nội sinh. Nếu quá nhiều NO được sinh ra thì sự dãn mạch máu sẽ dẫn đến sự giảm huyết áp, và ngược lại, nếu lượng NO sinh ra ít sẽ dẫn đến hiện tượng tăng huyết áp. Sự rối loạn con đường chuyển hĩa L-arginin – NO làm thay đổi nồng độ NO tạo ra. Những sự rối loạn này thường dẫn đến một số bệnh như: chứng tăng huyết áp, tiểu đường, béo phì, suy tim, xơ vữa động mạch, lão hĩa, tổn thương mạch máu. Ngồi ra, khi lượng NO sản xuất q nhiều thì chính nĩ sẽ trở thành chất nội độc tố và khi
Hình 2. 3 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu tại các bước sĩng của phân tử
24 đĩ NO cịn phản ứng với các ROS gây hại cho cơ thể, ví dụ gốc tự do ONOO-, là gốc nitrite gây hại cho cơ thể.
NO• + •O2- ↔ ONOO- 4NO• + O2 + H2O ↔ NO2- + H+
Nguyên tắc NO phản ứng với oxy tạo ra sản phẩm bền vững là nitrite và nitrate, hoạt chất ức chế NO sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả là làm giảm sản phẩm nitrit tạo thành trong dung dịch nước và nồng độ nitrite trong dung dịch nước được xác định bằng phương pháp trắc quang sử dụng thuốc thử Greiss. Trong đĩ, nitrite phản ứng với thuốc thử Greiss tạo thành hợp chất màu diazo bền vững và cĩ bước sĩng hấp thu cực đại ở 540 nm. Dựa trên sự giảm nồng độ nitrite tạo thành, ta tính được khả năng ngăn chặn gốc tự do NO của hoạt chất (tính trên % ức chế).
Hình 2. 4 Cơ chế phản ứng lên màu nitrite bằng thuốc thử Greiss phản ứng lên màu
nitrite bằng thuốc thử Greiss
Thuốc thử Greiss là hỗn hợp của hai dung dịch: N-1-napthylethylene diamine dihydrochloride (NED) và sulfanilamide trong mơi trường H3PO4. Cơ chế của phản ứng tạo sản phẩm màu diazo hĩa như trên.
2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng MDA
MDA (Malonyl dialdehyde) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hĩa lipid màng tế bào nên được áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá trình peroxy hĩa lipid của màng tế bào. Nguyên tắc MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hĩa lipid màng tế bào, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở
25 bước sĩng 532 nm, phản ứng được thực hiện ở mơi trường pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100oC trong thời gian từ 10 đến 15 phút. Dựa trên sự giảm cường độ hấp thu của phức ta tính được khả năng kháng oxy hĩa của chất cần nghiên cứu. Phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric được biểu diễn như sau:
Hình 2. 5 Cơ chế phản ứng lên màu của MDA và Acid thiobarbituric 2.4 Ứng dụng sĩng siêu âm trong trích ly
Siêu âm là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và cĩ tiềm năng phát triển trong ngành cơng nghệ thực phẩm. Kỹ thuật cổ điển trong q trình trích ly chất tan của ngun liệu là dựa vào việc lựa chọn chính xác các loại dung mơi trích ly cĩ độ hịa tan thích hợp kết hợp với sử dụng nhiệt và/hoặc khuấy đảo. Ngày nay người ta đang áp dụng vào q trình trích ly cơng nghệ cĩ hỗ trợ sĩng siêu âm giúp làm tăng khả năng trích ly của các quy trình trích ly truyền thống.
Nguyên lý tác động của sĩng siêu âm: Cơ chế xâm thực khí của sĩng siêu âm: Khi sĩng siêu âm truyền vào mơi trườngchất lỏng, các chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành. Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở rất gần nhau nhờ liên kết hĩa học. Khi cĩ sĩng siêu âm, trong chu trình nén các phân tử ở gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa. Áp lực âm trong chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành những bọt khí nhỏ. Trong q trình dao động, bọt khí ổn định cĩ thể trở thành bọt khí tạm thời. Sĩng siêu âm rung động những bọt khí này, tạo nên hiện tượng “sốc sĩng”. Bọt khí ổn định cĩ thể lơi kéo những bọt khí khác vào trong trường sĩng, kết hợp lại với nhau và tạo thành dịng nhiệt nhỏ. Các bọt khí tạm thời cĩ kích thước thay đổi rất nhanh, chỉ qua vài chu trình chúng bị vỡ ra, hình thành nên những điểm cĩ nhiệt độ và áp suất cao đạt được trong bong bĩng nổ. Hiện tượng xâm thực khí mở đầu cho rất
26 nhiều phản ứng do cĩ sự hình thành các ion tự do trong dung dịch, thúc đẩy các phản ứng hĩa học, hỗ trợ chiết xuất các chất tan.
Hiện tượng vi xốy: Sĩng siêu âm cường độ cao truyền vào trong chất lỏng sẽ gây nên sự kích thích mãnh liệt. Tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha lỏng/rắn hay khí/rắn, sĩng siêu âm gây nên sự hỗ loạn cực độ do tạo thành những vi xốy. Hiện tượng này làm tăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy xảy ra sự khuếch tán ở 1 vài trường hợp mà sự khuấy trộn thơng thường khơng đạt được.
2.5 Tổng quan về các chủng vi khuẩn thử nghiệm 2.5.1 Vi khuẩn Staplylococcus aureus [16] 2.5.1 Vi khuẩn Staplylococcus aureus [16]
2.5.1.1 Giới thiệu chung
Staphylococcus aureus, hay tụ cầu vàng là một lồi tụ cầu khuẩn Gram-dương kỵ
khí tùy nghi, và là nguyên nhân thơng thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các lồi tụ cầu. Nĩ là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da. Khoảng 20% dân số lồi người là vật mang lâu dài của S. aureus. Sắc tố carotenoid staphyloxanthin làm nên tính chất màu vàng của 'S. aureus', vốn cĩ
thể thấy được từ các khúm cấy trên thạch của vi khuẩn này. Sắc tố đĩng vai trị là một tác nhân độc hại cĩ tính chất chống ơxy hĩa giúp cho vi sinh vật khơng bị chết bởi các chủng oxy gây phản ứng được sử dụng bởi hệ thống miễn dịch. Các tụ cầu thiếu sắc tố sẽ dễ dàng bị tiêu diệt bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể ký chủ.
27 Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đĩ ơng sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trị của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng.
Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân
lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học.
Năm 1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự hiện diện của hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nĩ. Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi.
2.5.1.2 Phân loại khoa học
Giới (Kingdom): Eubacteria Nghành (Division): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Bacillales
Họ (Family): Staphylococcaceae Chi (Genus): Staphylococcus
Lồi (Species): Staphylococcus aureus.
2.5.1.3 Hình thái
Hình 2.7 Hình thái của vi khuẩn
Staphylococcus aureu
Hình 2.8 Quan sát dưới kính hiển vi
28 Một số dịng S. aureus cĩ khả năng gây tan máu trên mơi trường thạch máu, vịng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều cĩ vịng tan máu hẹp hơn so với đường kính khuẩn lạc. Hầu hết các dịng S. aureus đều tạo sắc tố vàng, nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuơi cấy cịn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuơi cấy ở nhiệt độ phịng. Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong mơi trường cĩ hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này cĩ thể bẻ gãy và sử dụng (Collin C.H và cs, 1995).
Trên mơi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus cĩ màu đen nhánh, bĩng, lồi, đường kính 1-1.5 mm, quanh khuẩn lạc cĩ vịng sáng rộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lịng đỏ trứng của lethinase) (Rosamund M B. và cs, 1995; Mary K. S. và cs, 2002). Trên mơi trường MSA (Mannitol salt agar) hay cịn gọi là mơi trường Chapman, khuẩn lạc trịn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng mơi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol)(Mary K. S. và cs, 2002).
Bảng 2. 1 Đặc điểm sinh hĩa của S. aureus
Đặc tính S. aureus
Catalase +
Coagulase +
Thermonuclease +
Nhạy với Lysostaphin +
Sử dụng glucose +
Sử dụng manitol +
2.5.1.4 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố
Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi tùy thuộc vào từng dịng. S. aureus cĩ khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7–48oC, với nhiệt độ cực thuận là 30–45oC; khoảng pH 4,2-9,3, với độ pH cực thuận là 7-7,5, và trong mơi trường chứa trên 15% NaCl. Tụ cầu bền vững khi cĩ nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%, nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu
29 vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế.
Ngồi ra, chúng cịn cĩ khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy mĩc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khơ và lọc thấm. Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S. aureus cĩ sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ
da, màng nhày, tĩc và mũi của người và động vật máu nĩng. S. aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh cĩ thể sống tốt bên ngồi kí chủ. Vi khuẩn này cịn cĩ mặt trong khơng khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn. Tuy nhiên, S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 60oC từ 2-50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật khác ức chế (Bremer P.J và cs, 2004).
Cĩ 10 - 50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S. aureus (Bremer P.J và cs,
2004). Tuy nhiên khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S. aureus cũng
rất lớn do chúng phân bố ở khắp nơi và cĩ khả năng sinh độc tố. Tụ cầu nhiễm thực phẩm vào chủ yếu qua con đường chế biến cĩ các cơng đoạn tiếp xúc trực tiếp với người. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều 12 kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm sốt nhiệt độ trong các cơng đoạn chế biến khơng tốt. Tuy nhiên, điều đĩ khơng đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đĩ sẽ gây độc, điều đĩ chỉ xảy ra khi S. aureus được phân lập tạo độc tố. Ngược lại, chỉ với một lượng nhỏ S. aureus tạo độc tố cũng cĩ thể gây ngộ độc (Reginald W. B. và cs, 2001).
2.5.1.5 Khả năng gây bệnh
Tụ cầu vàng thường ký sinh ở da và mũi họng. Vi khuẩn này gây bệnh cho những người bị suy giảm đề kháng do chúng cĩ nhiều yếu tố độc lực. Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và cĩ khả năng gây nhiều bệnh khác nhau (Lê Huy chính, 2001):
- Nhiễm khuẩn da: do tụ cầu ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên nĩ cĩ thể xâm nhập qua lỗ chân lơng, chân tĩc hoặc các tuyến dưới da. Sau đĩ gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ : mụn nhọt, các ổ áp xe, eczema, hậu bối. Mức độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi
30 khuẩn. Nhiễm tụ cầu ngồi da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch. Đinh râu cĩ thể gây nên những biến chứng nguy hiểm.
- Nhiễm khuẩn huyết: tụ cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn đường huyết nhất. Do chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngồi da, từ đây vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn đường huyết. Ðây là một nhiễm trùng rất nặng. Từ nhiễm khuẩn đường huyết tụ cầu đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc viêm nội tâm mạc. Cĩ thể gây nên các viêm tắc tĩnh mạch. Một số nhiễm trùng khu trú này trở thành viêm mãn tính như viêm xương.
- Viêm phổi: viêm phổi do tụ cầu vàng rất ít gặp. Nĩ chỉ xảy ra sau khi viêm đường hơ hấp do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết. Tuy vậy cũng cĩ viêm phổi tiên phát do tụ cầu vàng ở trẻ em hoặc người suy yếu. Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân này khá cao, vì thế nĩ được coi là bệnh nguy hiểm.
- Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp: ngộ độc thức ăn do tụ cầu cĩ thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc do tụ cầu cư trú ở ruột chiếm số lượng ưu thế. Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh cĩ hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn chí bình thường của đường ruột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện cho tụ cầu vàng (kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng.
- Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính. Sau ăn phải thức ăn nhiễm phải độc tố tụ cầu 2-8 giờ, bệnh nhân nơn và đi ngồi dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nơn chủ yếu là nước. Do mất nhiều nước và chất điện giải nên cĩ thể dẫn tới sốc. Ngồi bệnh nguyên nhân do tụ cầu một số trường hợp cĩ thêm vai trị của Clotridium diffiticile, sau khi dùng kháng sinh cĩ hoạt phổ rộng.