CHƯƠNG 1 : ĐẶT VẤN ĐỀ
2.5 Tổng quan về các chủng vi khuẩn thử nghiệm
2.5.2.4 Đặc điểm sinh hĩa
Cĩ tính chất chung của họ Enterobacteriaceae: Oxydase (-); Glucose (+); Khử NO3 thành NO2.
- Phản ứng [+]: Lên men glucose và nhiều
loại đường khác, đa số các chủng lên men đường lactose, Đỏ methyl, Indol, Sinh hơi.
- Phản ứng [-]: Citrat,Urea, H2S.
Bảng 2. 2 Đặc điểm sinh hĩa của E.coli
Đặc tính E. coli Lactose + Glucose + Sinh hơi + H2S - Urea - Indol + Citrat - 2.5.2.5 Nuơi cấy
E.coli phát triển dễ dàng trên các mơi trường nuơi cấy thơng thường. Một số cĩ thể
phát triển trên mơi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu kỵ khí tuỳ tiện. Cĩ thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 – 40°C.
Trong những điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ
33 làm đục nhẹ mơi trường, sau 24 giờ làm đục đều, sau hai ngày trên mặt mơi trường cĩ váng mỏng. Những ngày sau dướii đáy ống cĩ thể thấy cặn.
Trên mơi trường thạch thường, sau khoảng 8 – 10h, dùng kính lúp đã cĩ thể quan sát được khuẩn lạc. Sau 24h khuẩn lạc khoảng 1.5 mm. Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng II nhưng cũng cĩ thể gặp dạng R hoặc M.
2.5.2.6. Khả năng gây bệnh
Dựa vào tính chất gây bệnh,người ta chia E. coli thành các loại: ✓ EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đường ruột. ✓ ETEC (Enterotoxigenic E. coli): E. coli sinh độc tố ruột.
✓ EIEC (Enteroinvasive E. coli): E. coli xâm nhập đường ruột. ✓ EAEC (Enteroadherent E. coli): E. coli bám dính đường ruột.
✓ EHEC (Enterohaemorragic E. coli): E. coli gây chảy máu đường ruột.
Trong đường tiêu hĩa, E. coli chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%).
Tuy nhiên, E. coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nĩ đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết.
E. coli cĩ thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết
thương. Tính kháng thuốc của E. coli đứng thứ hai (sau S.aureus) trong các vi
khuẩn gây bệnh thường gặp.
2.5.3 Vi khuẩn Bacillus Cereus [14] 2.5.3.1 Giới thiệu chung 2.5.3.1 Giới thiệu chung
B.cereus là trực khuẩn kỵ khí, gram dương, rộng khoảng 1μm, dài khoảng 3-4μm,
cĩ khả năng sinh nha bào, bào tử dạng hình ovan cĩ thể sống sĩt khi xử lý nhiệt và hĩa chất, chúng cĩ khả năng thích nghi với một loạt các điều kiện mơi trường, nĩ được phân phối rộng rãi trong tự nhiên như trong bụi, đất ở các lồi động vật khác nhau, thường thấy trong những hạt, ngũ cốc, gạo, bột hoặc thực phẩm khơ lẫn lộn chung với nhau như gạo, mì, khoai,.. do bị nhiễm từ đất trong quá trình trồng trọt và thu hoạch.
34
2.5.3.2 Phân loại khoa học
Vi khuẩn khơng tạo giáp mơ, khơng cĩ khả năng di động theo phân loại quốc tế Giới (Kingdom): Bacteria
Nghành (Plylumm): Pirmicute
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Bacillales Họ (Family): Bacillaceaem Chi (Genus): Bacillus Lồi (Species): Cereus.
Trong chi bacillus này ngồi lồi cereus cịn cĩ một số lồi như:
- Bacillus subtilis - Bacillus coagulans - Bacillus thuringiensis - Bacillus natto - Paenibacillus larvae 2.5.3.3. Hình thái
Bacillus cereus là lồi vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, cĩ khả năng sinh
nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. từ những năm 1972 đến 1986 cĩ tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus
cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên
35
Hình 2. 11 Bacillus cereus dưới kính
hiển vi
Hình 2. 12 Bacillus cereus trên thạch
máu cừu
2.5.3.4 Đặc điểm sinh hĩa
Trên mơi trường đường:
- Lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, khơng lên men mannitol. - Khử Nitrat thành Nitrit.
- Phản ứng VP (+) - Phân giải Tyroxin - Catalase (+), Citrate (+)
- Mọc trên NB + 0,001% lyzozym1.
2.5.3.5 Đặc điểm nuơi cấy
- Là loại vi khuẩn dễ mộc - Hiếu khí và kị khí tùy nghi. - Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-40oC. - pH 4.5-9.3, thích hợp 7-7.2
- Trên mơi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo khĩm lớn, nhăn nheo, xù xì. - Trên mơi trường BA tạo dung huyết rộng.
- Trên mơi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khĩm hồng chung quanh cĩ vịng sáng.
36 Triệu chứng: Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
Tính chất gây bệnh - Độc tố -Triệu chứng: Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
37
CHƯƠNG 3: NỘI DUNG THỰC HIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung thực hiện
3.1.1 Dụng cụ
Nhiệt kế, bếp điện, giấy lọc whatman, dụng cụ thủy tinh các loại (ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức 250; 100; 500; 1000 mL; phễu thủy tinh, pipet, đũa thủy tinh...), micropipet (eppendorf, Đức).
3.1.2 Hĩa chất
STT Hĩa chất Xuất xứ
1 Ethanol 99.5% Việt Nam
2 Hexan Merck
3 Ethyl Acetat Merck
4 2,2- diphenyl -1- picrylhydrazyl Sigma-Aldrich
5 Vitamin C Việt Nam
3.1.3 Thiết bị
Hình 3. 1 Máy đo quang phổ Thermo –
Genesys 20
38
Hình 3. 3 Thiết bị sấy thăng hoa
Labogene
Hình 3. 4 Máy cơ quay chân khơng
Heidolph
39
3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Xử lý vỏ chơm chơm chơm: 3.2.1 Xử lý vỏ chơm chơm chơm:
Quả chơm chơm đem tách lấy vỏ rửa sạch sau đĩ cho vào thiết bị đơng sâu trong vịng 24h. Vỏ chơm chơm được đem loại bỏ nước bằng phương pháp sấy thăng hoa trong 24h. Vỏ chơm chơm khơ được đem đi nghiền thu được bột cĩ màu hồng nhạt với kích thước 0.5 mm.
40
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nước trong hệ dung mơi đến hiệu suất trích ly
Cân 10g bột vỏ chơm chơm sau đĩ cho thêm 100 mL ethanol rồi đem hỗn hợp trên đánh siêu âm và đun hồn lưu trong 10 phút, lọc lấy dung dịch, thêm vào dung mơi hexan: ethyl acetat với tỷ lệ 15:85. Dung dịch thu được đem lắc đều và loại bỏ dung mơi bằng cách cơ quay ở nhiệt độ 70-80oC tạo ra chiết xuất vỏ chơm chơm. Sau đĩ, tiếp tục làm với các mẫu chơm chơm khác lần lượt các tỉ lệ C2H5OH: H2O là 90:10, 80:20, và 70:30.
3.2.3 So sánh ảnh hưởng của phương pháp đun hồn lưu kết hợp vi sĩng và đun hồn lưu
Cân 10g bột vỏ chơm chơm sau đĩ cho thêm 100 mL ethanol đem hỗn hợp trên đánh siêu âm và đun hồn lưu trong thiết bị vi sĩng 10 phút, lọc lấy dung dịch, thêm vào dung mơi hexan: ethyl acetat (15:85) đem đi bay hơi dung mơi bằng cách cơ quay ở nhiệt độ 70 - 80oC thu được bột chiết xuất vỏ chơm chơm. Sau đĩ, tiếp tục làm với các mẫu chơm chơm khác lần lượt các tỉ lệ C2H5OH: H2O là 90:10, 80:20, và 70:30. Và tiến hành tính và so sánh hiệu suất của hai phương pháp trích ly dịch chiết.
3.2.4 Khảo sát khả năng kháng oxy hĩa của hợp chất trích ly từ vỏ chơm chơm với các tỷ lệ khác nhau với các tỷ lệ khác nhau
Các chất cĩ khả năng kháng oxy hĩa sẽ trung hịa gốc tự do DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sĩng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Cụ thể, cân 13 mg DPPH thêm 100 mL ethanol sau đĩ tiếp tục hút 10 mL dung dịch này pha lỗng với 45 mL ethanol, để ổn định trong tối. 2.9 mL DPPH và 0.1 mL mẫu với các nồng độ 150, 125, 100, 75, 50 và 25 ppm. Tiếp tục tiến hành đo quang ở bước sĩng 515 nm. Lần lượt thực hiện với các sản phẩm trích ly ở các tỉ lệ C2H5OH:H2O 100:0, 90:10, 80:20 và 70:30. Tương tự các bước thực hiện hiện trên với dung dịch đối chứng Vitamin C cĩ nồng độ 150, 125, 100, 75, 50 và 25 ppm. Để xác định hoạt tính kháng oxy hĩa của sản phẩm ta tính theo cơng thức:
41 Trong đĩ:
A0: độ hấp thụ của mẫu đối chứng. A: độ hấp thu của dung dịch phản ứng
42
Hình 3. 8 Kết quả xây đựng đường chuẩn của hợp chất trích ly từ vỏ chơm chơm ở
tỷ lệ ethanol: nước (70:30)
3.2.5 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của hợp chất trích ly từ vỏ chơm chơm
Cân 0.25 gam mẫu cặn chiết chơm chơm pha với 10mL nước cất. Nồng độ dung dịch lúc này là 0.025g/mL và sử dụng đối chứng dương là ethanol. Chuẩn bị ba loại vi khuẩn Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichis coli.
Chuẩn bị mẫu thuốc kháng sinh để đối chiếu, cân chính xác 250 mg thuốc kháng sinh cần thử, hịa tan vào 10mL nước cất, nếu thuốc khơng tan trong nước thì hịa tan với DMSO, ta sẽ được nồng độ dung dịch 250mg/mL. Dung dịch để bảo quản trong tủ lạnh.
Chuẩn bị đĩa mơi trường Tryptic Soy Agar (TSA) cho cả ba loại vi khuẩn, đĩa mơi trường dày 6mm. Dùng tăm bơng vơ khuẩn nhúng vào huyền dịch vi khuẩn (mật độ 108 tế bào/mL), trải mẫu trên đĩa mơi trường, để ráo.
Dùng micro pipet hút 12 µL nhỏ lần lượt mẫu pha lỗng vào đĩa mơi trường đã trải khuẩn. Đối chứng dương sử dụng gentamicin 10µg.
43 Ủ mẫu ở nhiệt độ phịng khoảng 30 phút cho dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra mơi trường nuơi cấy vi khuẩn. Sau đĩ ủ trong tủ ủ 37oC trong 24 giờ.
Đọc kết quả: đo kích thước vịng vơ khuẩn . Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình.
Lưu ý: phương pháp trên đều được thực hiện trong tủ cấy để hạn chế tối đa khả năng nhiễm các loại vi khuẩn khác từ mơi trường bên ngồi.
3.3 Các phương pháp phân tích
3.3.1 Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại
Các liên kết trong cấu trúc của vật liệu được xác định bằng phương pháp hồng ngoại FT– IR được thực hiện trên thiết bị FT-IR Jasco tại phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ Hĩa học, trường Đại học Cơng nghiệp Tp. HCM với tần số dao động từ 4000 - 400 cm-1
3.3.2 Phương pháp trích ly dịch chiết vỏ chơm chơm
Tiến hành nghiên cứu và so sánh hiệu quả của hai phương pháp trích ly: đun hồn lưu và vi sĩng đồng thời ứng dụng sĩng siêu âm trong trích ly. Thí nghiệm được thực hiện trên thiết bị máy rửa siêu âm Elma khơng cài nhiệt độ và thời gian siêu âm được thực hiện trong 20 phút.
3.3.3 Phương pháp quét gốc tự do DPPH
Phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện. Phương pháp này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hĩa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm ban đầu.
Nguyên tắc: DPPH là gốc tự do ổn định, khơng tự kết hợp đề tạo thành nhị nhân tử. Gốc tự do cĩ màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đơi. Chất cĩ tác dụng chống oxi hĩa sẽ làm giảm màu của DPPH. Sự mất màu này là do các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một H của chất nghiên cứu để tạo thành DPPH dạng nguyên tử. Hoạt tính quét gốc tự do của chất nghiên cứu tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH. Xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sĩng 515 nm.
44
Hình 3. 7 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu tại các bước sĩng của phân tử DPPH ở dạng
45
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ ethanol: nước đến hiệu suất trích ly
Khi giảm nồng độ ethanol, thì hiệu suất trích ly càng cao, nhưng màu sắc của sản phẩm cũng thay đổi theo tỉ lệ nước, ở tỉ lệ ethanol 100 sản phẩm cĩ độ xốp hơn, màu nhạt hơn. Điều này cĩ thể do khi loại bỏ dung mơi ethanol tinh khiết cần cần thời gian ngắn hơn dẫn đến màu ít bị sậm. Khi giảm tỉ lệ ethanol, sản phẩm cĩ màu sậm hơn do thời gian cơ quay loại bỏ dung mơi dài hơn (Hình 4.1). Kết quả hiệu suất trích ly cho thấy, khi tăng tỷ lệ nước trong dung mơi trích ly làm tăng hiệu suất trích các hợp chất từ vỏ quả chơm chơm. Hiệu suất trích ly tăng từ 24.86 cho đến 42.87% tương ứng với tỉ lệ nước tăng từ 0 đến 30% (Bảng 4.1).
Hình 4. 1 Sản phẩm trích ly của vỏ chơm chơm Rong Riêng với nhiều tỉ lệ
46
Bảng 4. 1 Kết quả hiệu suất trích ly của vỏ chơm chơm ở các tỉ lệ dung mơi khác
nhau Tỷ lệ dung mơi Dịch chiết vỏ chơm
chơm (g)
Sau khi sấy (g) Hiệu suất trích ly (%) 100 1.37 1.24 24.86 90:10 1.48 1.33 26.68 80:20 1.82 1.77 35.39 70:30 2.26 2.14 42.87
4.2 Kết quả so sánh ảnh hưởng của phương pháp đun hồn lưu kết hợp vi sĩng và phương pháp đun hồn lưu đến hiệu suất trích ly và phương pháp đun hồn lưu đến hiệu suất trích ly
Kết quả thí nghiệm cho thấy khi trích lý các hoạt chất bằng phương pháp vi sĩng cĩ ảnh hưởng đáng kể lên hiệu suất trích ly hoạt chất từ chơm chơm và thời gian thực hiện trích ly ngắn hơn so với phương pháp đun hồn lưu thơng thường. Sản phẩm trích ly thu được cĩ hiệu suất giảm dần khi tăng hàm lượng ethanol từ 70 lên 100% (Bảng 4.1). Hiệu suất trích ly thu được cao nhất ở phương pháp vi sĩng là 44,12% cao hơn phương pháp đun hồn lưu là 42.87%. Đồng thời ở các tỷ lệ khác hiệu suất trích ly của phương pháp vi sĩng cũng tăng đáng kể so với phương pháp đun thơng thường (Hình 4.2).
47
Hình 4. 2 Đồ thị so sánh hiệu suát trích ly vỏ chơm chơm Rong Riêng bằng
phương pháp vi sĩng và đun hồn lưu
4.3 Kết quả khả năng kháng oxy hĩa của hợp chất trích ly từ vỏ chơm chơm với các tỷ lệ khác nhau
Kết quả cho thầy hiệu suất chống oxy hĩa cao nhất ở chiết xuất tỉ lệ ethanol 80% của chơm chơm Rong Riêng, tiếp theo là với hàm lượng nước 10% và 30%
Bảng 4. 2 Khả năng kháng oxy hĩa (%) của dịch chiết bằng phương pháp đun hồn
lưu tại các nồng độ khác nhau Nồng độ (PPM) Tỷ lệ C2H5OH:H2O 100 90:10 80:20 70:30 25 13.46 12.16 14.91 17.80 50 24.02 21.27 27.79 39.07 75 33.57 35.17 36.76 33.43 100 38.49 43.56 45.15 48.77 125 45.59 49.93 47.76 53.11 150 53.40 68.45 71.20 66.43
48
Hình 4. 3 Sơ đồ thể hiện khả năng kháng oxy hĩa của dịch chiết bằng phương pháp
đun hồn lưu với các tỷ lệ ethanol: nước khác nhau
4.4 Ảnh hưởng của phương pháp đun hồn lưu kết hợp vi sĩng đến khả năng kháng oxy hĩa của các hợp chất trích ly từ vỏ chơm chơm Rong Riêng kháng oxy hĩa của các hợp chất trích ly từ vỏ chơm chơm Rong Riêng
Khả năng kháng oxy tốt nhất ở phương pháp đun hồn lưu là ethanol 80%, cịn phương pháp vi sĩng là ethanol 70%. Khả năng kháng oxy hĩa của phương pháp vi sĩng tăng vượt trội so với phương pháp đun hồn lưu thơng thường, cụ thể là khả năng kháng oxy hĩa của vi sĩng cao nhất là 85.24% (ethanol 70%) cịn đun hồn lưu là 71.2% (ethanol 80%). Đồng thời ở các tỉ lệ khác nhau khả năng kháng oxy hĩa của vi sĩng cao hơn hẳn so với phương pháp đun hồn lưu thơng thường.
49
Bảng 4. 3 Khả năng kháng oxy hĩa (%) của dịch chiết bằng phương pháp vi sĩng
Nồng độ (PPM) Tỷ lệ C2H5OH:H2O 100 90:10 80:20 70:30 25 24.89 34.01 19.25 35.31 50 47.32 47.47 35.17 46.45 75 49.06 50.36 50.51 57.6 100 57.45 72.21 66.28 64.25 125 67.15 68.16 72.07 71.92 150 73.81 67.00 75.54 85.24
Hình 4. 4 Sơ đồ thể hiện khả năng kháng oxy hĩa của dịch chiết bằng phương pháp
50
4.5 Kết quả kháng khuẩn của các hợp chất trích ly từ vỏ chơm chơm Rong Riêng Riêng
(a) (b)
(c)
Hình 4. 5 Kết quả kháng khuẩn Bacillus cereus (a), Staphylococcus aureus (b),