Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu mô tả cắt ngang, tiến cứu, có nhóm chứng so sánh.
2.2.2. Cá ch chọn mẫu
- Cỡ mẫu: sử dụng cơng thức tính cỡ mẫu mơ tả mợt giá trị trung bình [14].
Trong đó:
n: Số bệnh nhân mắc VLĐTTCM cần nghiên cứu.
Z1-α/2: Hệ số giới hạn tin cậy, với mức tin cậy 95% → Z1-α/2 = 1,96
: Nồng độ cytokin trung bình ở bệnh nhân VLĐTTCM ước tính theo các
nghiên cứu trước.
: độ lệch chuẩn của cytokin từ nghiên cứu trước : độ chính xác tương đối, chọn = 0,2
Theo nghiên cứu trước, nồng độ TNF-α là 17,78 ± 11,62 [34], chọn α=0,05, =0,2, thay vào cơng thức trên, tính được n= 42.
Tương tự với các cytokin khác như sau: Nồng độ IL-1β là 1,35 ± 1,21 [100], n=78 Nồng độ IL-6 là 26 ± 10 [47], n= 14 Nồng độ IL-8 là 204 ± 138,0 [83], n= 44 Nồng độ IL-10 là 4,40 ± 1,55 [100], n=12
Như vậy để cỡ mẫu đủ lớn cho việc xác định nồng độ các cytokin, nghiên cứu được tiến hành với cỡ mẫu n =78.
- Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu thuận tiê ̣n có chủ đích, trong quá trình thu thập số liệu đã chọn 78 bê ̣nh nhân đủ tiêu chuẩn bê ̣nh VLĐTTCM,
đối chiếu với cỡ mẫu được tính theo cơng thức tính trên thì số lượng bê ̣nh nhân như vậy đảm bảo đô ̣ tin câ ̣y.
- Nhó m chứng: cho ̣n 30 người đến khám bê ̣nh vì kiểm tra sức khỏe.
2.2.3. Cá c chỉ tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu lâm sàng:
- Tuổi: tính theo năm và chia làm 6 nhóm tuổi: < 20; 20 - 29; 30 - 39; 40-49, 50-59 và ≥ 60.
- Giới tính: nam, nữ
- Thời gian mắc bệnh: < 1 năm, 1 - 5 năm, 6 -10 năm, > 10 năm. - Các triệu chứng toàn thân:
+ Sốt: chia 3 mức theo Langan RC [63] (nhẹ: không sốt, vừa: sốt 3702 - 3708, nặng: sốt > 3708).
+ Sút cân: dựa vào mức độ sút cân tính theo trọng lượng cơ thể của Langan RC [63] chia 3 mức (nhẹ: không sút cân, vừa: sút cân 1-10%, nặng: sút cân > 10%).
+ Đại tiện phân máu nhiều lần trong ngày. Rối loạn phân. Tính chất phân bao gồm: lỏng lẫn nhày, dây máu, máu đỏ tươi, máu đỏ thẫm.
+ Số lần đại tiện: được chia 3 mức độ theo Langan RC (nhẹ: < 4 lần/ ngày; vừa: 4 - 6 lần/ ngày; nặng: > 6 lần/ ngày) [63].
+ Mức độ thiếu máu: chúng tôi chia 3 mức là nhẹ, vừa và nặng [10] Nhẹ: Hb từ 90 - < 120 g/l
Vừa: Hb từ 60 - < 90 g/l Nặng: Hb dưới 60 g/l
+ Phân loại mức độ bệnh: chúng tôi chia 3 mức độ, nhẹ, vừa và nặng dựa theo tiêu chí phân loại của Sutherland [99]:
Nhẹ: 3 - 5 điểm Vừ a: 6 - 10 điểm Nặng: 11 - 12 điểm
(cá ch ghi điểm cho các mức độ được trình bày cụ thể ở phần các tiêu chuẩn dù ng trong nghiên cứu).
Có rất nhiều các tiêu chuẩn đánh giá mức đô ̣. Trong nghiên cứu này chú ng tôi sử du ̣ng tiêu chuẩn phân loa ̣i mức đô ̣ của Sutherland vì dễ áp du ̣ng và đã có nhiều nghiên cứu sử du ̣ng.
- Công thức máu: dựa vào phân loại mức độ mất máu [2] chúng tôi chia các mức giảm đối với hồng cầu, Hb.
+ Hồng cầu chia bình thường và 2 mức giảm (> 3 x 1012/l; 2,5 - 3 x 1012/l và < 2,5 x 1012/l).
+ Hb: chia bình thường và 3 mức giảm (nhẹ: Hb từ 90 - < 120 g/l, vừa: Hb từ 60 - < 90 g/l, nặng: Hb dưới 60 g/l).
+ Số lượng bạch cầu: dựa vào giá trị bình thường [6], chia 2 mức tăng và bình thường (≥16 G/l, >10 - 15 G/l và ≤ 10 G/l).
- Máu lắng 1giờ: chia mức tăng và bình thường (>20 mm/h và ≤ 20 mm/h).
* Các xét nghiệm sinh hóa
Các xét nghiệm sinh hóa được tiến hành tại khoa Sinh hóa Bệnh viện Bạch Mai trên hệ thống máy sinh hóa - miễn dịch Cobas 8000 của hãng Roche.
- CRP: chia mức tăng và bình thường (> 1 mg/dL và 1 mg/dL). - Albumin: chia 2 mứ c giảm và bình thường(bình thường 43 - 51g/l, giảm vừa 30 - <43g/l, giảm nă ̣ng <30 g/l).
- Kali huyết: dựa vào giá trị bình thường [6] chúng tơi chia kali mức
bình thường và 2 mức giảm (≥ 3,5 mmol/L, 2,6 - 3,4 mmol/L và ≤ 2,5mmol/L).
Nghiên cứu miễn dịch:
- Xét nghiệm điện di protein huyết thanh.
Dựa vào giá trị bình thường của các phần protein khi điện di [6], chúng tôi chia các mức như sau:
Bảng 2.1. Các mức thành phần protein khi điện di Các phần protein (%) Các phần protein (%) Mức α1 α2 β γ Bình thường 2 – 3,5 5,4 - 10,6 7 - 14 8 - 18 Giảm < 2 < 5,4 < 7 < 8 Tăng > 3,5 > 10,6 > 14 > 18
- Xét nghiệm các globulin miễn dịch toàn phần trong huyết thanh. Giá trị bình thường được sử dụng chuẩn hóa theo máy xét nghiệm chia bình thường và tăng như sau:
Bảng 2.2. Các mức globulin miễn dịch Globulin Globulin
Mức IgA(mg/dL) IgG(mg/dL) IgM(mg/dL) IgE(U/ml)
Bình thường ≤ 400 ≤ 1600 ≤ 230 < 100
Tăng > 400 > 1600 > 230 ≥ 100
- Xét nghiệm định lượng nồng độ cytokine trong huyết thanh: chúng tôi đo nồng độ một số cytokine (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10).
Nghiên cứu nội soi và mô bệnh học:
- Nội soi đại tràng toàn bộ: đánh giá vị trí tởn thương theo phân loại của Montreal, hình thái, tính chất tổn thương và phân loại giai đoạn hoạt động theo Baron (trình bày cụ thể ở phần các tiêu chuẩn dùng trong nghiên cứu) [16].
- Mô bệnh học: được đánh giá theo tiêu chuẩn Nottingham 2000 (trình bà y cụ thể ở phần các tiêu chuẩn dùng trong nghiên cứu) [18].
- Phân loại mức độ viêm trên mô bệnh học, chúng tôi chia 5 độ theo Geboes K và CS [41] (trình bày cụ thể ở phần các tiêu chuẩn dùng trong nghiên cứ u), trong đó độ 1, 2 và 3 là mức độ nhẹ; 4, 5, 6 và 7 là mức độ nặng.
Nghiên cứ u TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10
- Xét nghiệm định lượng nồng độ TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 trong huyết thanh tiến hành sau khi thu thập đủ số lượng mẫu huyết thanh nghiên cứu và thực hiện xét nghiệm ta ̣i bô ̣ môn Miễn Di ̣ch của Học viện Quân Y.
- Các TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 được phân tích bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang sử dụng công nghệ xét nghiệm miễn dịch dựa trên nền tảng kỹ thuật phân tích dịng chảy (Flowcytometry-assisted immunoassay) trên hệ thống Luminex 200 và phần mềm điều khiển đi kèm do hãng Luminex (Mỹ) chế tạo và cài đặt với sinh phẩm đồng bộ do R&D (Mỹ) cung cấp. Kết quả được phân tích bởi Tiến sĩ Đỗ Khắc Đại - Phó bộ mơn Miễn dịch.
- Chúng tôi đánh giá hàm lươ ̣ng cytokin dựa trên so sánh với kết quả xét nghiệm ở nhóm chứng (là người khỏe mạnh) vì các cytokin khơng có hàm lượng chuẩn.