Kỹ thuật lấy máu xét nghiê ̣m sinh hóa, huyết học và miễn di ̣ch

Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. Kỹ thuật nghiên cứu

2.3.3. Kỹ thuật lấy máu xét nghiê ̣m sinh hóa, huyết học và miễn di ̣ch

Sau khi bệnh nhân được chẩn đoán VLĐTTCM trên lâm sàng và nội soi tiến hành lấy máu làm các xét nghiệm công thức máu, máu lắng, CRPhs, albumin, điện giải đồ, globulin miễn dịch, điện di protein và các cytokine. Lấy máu tĩnh ma ̣ch được tiến hành trên 78 bê ̣nh nhân (nhóm bệnh) và 30 người đến khám vì kiểm tra sức khỏe (nhóm chứng). Thời điểm lấy máu là trước 9 giờ sáng, chưa ăn sáng. Trước đó chưa đươ ̣c dùng thuố c điều tri ̣ nào hoă ̣c dù ng chế phẩm nào ức chế miễn di ̣ch.

+ Các xét nghiệm huyết học: tiến hành tại khoa huyết học Bệnh viện Bạch Mai và thực hiện trên máy XT - 400 của Sysmexa.

+ Các xét nghiệm sinh hóa: tiến hành ta ̣i Khoa Sinh hóa Bệnh viện Bạch Mai để xét nghiệm định lượng globulin huyết thanh trên hệ thống máy sinh hóa - miễn dịch Cobas 8000 của hãng Roche.

+ Xét nghiệm điện di protein huyết thanh: tiến hành thực hiê ̣n ta ̣i Khoa Huyết học được xét nghiê ̣m bằng phương pháp miễn dịch cố định tiến hành tại khoa Huyết học Bệnh viện Bạch Mai trên máy Hydrasys 2 scan của Sebia (Pháp).

Hình 2.2. Máy điện di protein Hydrasys 2 scan của Sebia

+ Xét nghiệm TNF-α, IL-1β,IL-6, IL-8,IL-10 trong huyết thanh: Lấy 2ml máu vào ống nghiệm khơng có thuốc chống đơng sau đó ly tâm tách lấy huyết thanh để xét nghiệm.

- Sinh phẩm xét nghiệm: Bộ sinh phẩm phát hiện đồng thời 9 cytokine

của người (gồm GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-5, IL-10, INF-γ, IL-8, IL-6, IL-4) do hãng R&D (Mỹ) sản xuất, bao gồm:

o Khay phản ứng: Đĩa nhựa 96 giếng chuyên dụng có đáy là màng lọc cho phép các phân tử nhỏ đi qua và hạt nhựa phản ứng có kích thước 8µm được giữ lại.

o Hạt nhựa gắn kháng thể: Hỗn hợp chứa tỷ lệ đều nhau của 8 loại hạt nhựa khác nhau, mỗi loại hạt nhựa hình cầu đường kính 8µm được gắn sẵn với kháng thể đơn clôn đặc hiệu với 1 cytokine cần phát hiện.

o Kháng thể phát hiện: Hỗn hợp chứa 8 kháng thể đơn clôn đặc hiệu với 8 cytokine kể trên đã gắn Biotin.

o Phức hợp chất huỳnh quang PE gắn Streptavidin.

o Hỗn hợp chuẩn chứa 8 cytokine của người cần phát hiện với nồng độ đã biết.

o Các dung dịch pha mẫu, dung dịch pha sinh phẩm, dung dịch rửa, dung dịch chạy máy do R&D (Mỹ) sản xuất và cung cấp.

Thiết bị phân tích: Hệ thống Luminex 200 và phần mềm điều khiển đi

kèm do hãng Luminex (Mỹ) chế tạo và cài đặt.

- Các bước xét nghiệm:

Bước 1: Chia đều 25l hỗn hợp các hạt nhựa đã gắn kháng thể vào các giếng

của khay phản ứng 96 giếng; cho 50l huyết tương hoặc các mẫu cytokine chuẩn với nồng độ đã biết vào các giếng. Ủ trong điều kiện lắc nhẹ theo vòng tròn với tốc độ 50 vòng/phút bằng máy lắc trong 30 phút tại nhiệt độ phòng cho các cytokine trong mẫu xét nghiệm bám vào hạt nhựa thông qua kháng thể đặc hiệu.

Bước 2: Rửa bằng phương pháp lọc hút qua màng lọc với máy hút chân

không để loại bỏ các thành phần không bám vào hạt, thu được các hạt có gắn kháng thể và kháng nguyên (cytokin) đặc hiệu.

Bước 3: Cho vào mỗi giếng 50l kháng thể phát hiện (là hỗn hợp kháng thể

đơn clôn kháng các cytokin cần phát hiện đã gắn biotin), ủ tiếp như bước 1 để kháng thể gắn biotin bám vào kháng nguyên (cytokin) hình thành phức hợp miễn dịch kiểu sanhdwich trên bề mặt hạt nhựa.

Bước 4: Rửa như bước 2 để thu được các hạt nhựa có phức hợp miễn dịch

kiểu sanhdwich (kháng thể kháng cytokin-cytokin-kháng thể kháng cytokin gắn biotin) trên bề mặt hạt nhựa.

Bước 5: Cho vào mỗi giếng 50 l dung dịch cộng hợp Streptavidin-PE và ủ

trong 15 phút như bước 1 cho chất mầu huỳnh quang PE gắn vào phức hợp miễn dịch thông qua tương tác Biotin-Sreptavidin.

Bước 6: Rửa như bước 2 thu được phức hợp kháng thể-kháng nguyên-kháng

- Nhận định kết quả cytokine:

Phân tích bằng hệ thống Luminex 200 và phần mềm điều khiển đi kèm

ở chế độ chọn độ nhạy cao. Nồng độ cytokin trong mỗi mẫu phân tích tỷ lệ thuận với mật độ huỳnh quang PE của hạt nhựa gắn kháng thể đặc hiệu với cytokin đó tiết ra. Nồng độ cytokin của mẫu xét nghiệm được tính bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của mẫu xét nghiệm với mật độ huỳnh quang của các nồng độ cytokin chuẩn. Đường chuẩn cho mỗi cytokin được xây dựng độc lập dựa vào nồng độ đã biết của cytokin đó trong mẫu cytokin chuẩn. Hệ thống được lập trình phân tích tối thiểu 200 hạt nhựa mỗi loại (tương ứng với mỗi cytokin) để giảm bớt sai sót có thể có do phản ứng miễn dịch diễn ra không đồng đều giữa các hạt nhựa.

Hình 2.4. Hệ thống máy Luminex Fluaroanalyzer