Nghiên cứu điển hình sử dụng cao chiết, dịch chiết thực vật kiểm soát bùng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.2. Sử dụng cao chiết thực vật và hoạt chất thiên nhiên để kiểm soát bùng nổ

1.2.2. Nghiên cứu điển hình sử dụng cao chiết, dịch chiết thực vật kiểm soát bùng

phát VKL độc

1.2.2.1. Dịch chiết từ rơm lúa mạch Hordeum vulgare

Nghiên cứu sử dụng rơm lúa mạch (Hordeum vulgare) như một hoạt chất diệt tảo, kiểm soát sự bùng phát sinh khối thực vật phù du được triển khai từ đầu những năm 1990. Gibson và cộng sự sử dụng dịch chiết phân hủy rơm lúa mạch để ức chế sinh trưởng của các loài Cladophorag lomerata, Chlorella vulgaris và Selenastrum

capricornutum với hiệu quả ức chế lên đến 63 % sau 6 tháng triển khai tại 20 0C [76]. Khi mẫu rơm được xử lý nhiệt bằng cách hấp thanh trùng, tác giả không quan sát thấy khả năng ức chế. Nguyên nhân gây ra sự ức chế sinh trưởng theo Gibson là do các hợp hợp chất phenolic đặc biệt là tannin được giải phóng ra từ q trình phân hủy

23

yếm khí rơm. Tuy nhiên, Pillinger phản biện cho rằng 3 loài nấm như Pycnidiophora

dispersa Clum (IMI 346597) và Z. leucotricha (Speg.) Mall. & Cain,

Cladorrhinumfoecundissimum Sacc. & Marchal được sinh ra trong q trình phân hủy

hiếu khí rơm là ngun nhân chính gây ra sự ức chế này [77]. Năm 1993, Jonathan lặp lại thí nghiệm trên M. aeruginosa dưới tác dụng của dịch chiết phân hủy rơm ghi nhận hiệu quả ức chế lên đến 95 % khi dùng 2,57 g sinh khối khô/m3 [78]. Theo Jonathan và

Pillinger, các hợp chất phenolic như axit p-coumaric, axit ferulic, axit tannic, đặc biệt là các hợp chất quinones như 2,6-dimethoxyphenol,2,6-dimethoxy-p-benzoquinon đóng vai trị quan trọng tạo nên hoạt tính diệt khuẩn của mẫu rơm. Năm 1996, Everall triển khai thử nghiệm dịch chiết rơm lên mẫu nước hồ thực tế với tỉ lệ 25 g/m3 và bước đầu ghi nhận những kết quả khả quan. Thực nghiệm cũng khẳng định việc ứng dụng dịch chiết rơm lên mẫu nước hồ không làm ảnh hưởng đến chất lượng của nguồn nước cũng như ổn định các điều kiện lý hóa của hệ sinh thái [79] .

Tuy nhiên năm 2003, Boylan chứng minh những hạn chế của phương pháp này như hiệu quả ức chế chỉ quan sát được sau 8-9 tuần triển khai, những tuần sau sinh khối thực vật phù du tiếp tục tăng mạnh đến tuần thứ 14 thì khơng cịn quan sát được vai trò ức chế của dịch chiết [80]. Ngoài ra trong suốt 12 tuần tác giả không quan sát thấy sự khác biệt sinh khối thực vật phù du giữa hai mẫu thực nghiệm bổ sung rơm với tỉ lệ 15 và 60 g/m3. Sự khác biệt hiệu quả ức chế của dịch chiết rơm so với kết quả của Everall, là do hàm lượng oxy hịa tan trong mẫu vì oxy đóng vai trị quan trọng thúc đẩy quá trình phân hủy rơm lúa mạch [79]. Khi hàm lượng oxy hòa tan thấp đã làm giảm hiệu quả ức chế sinh trưởng của rơm lúa mạch lên các loài thực vật phù du. Ferrier và cộng sự triển khai mẫu dịch chiết lên 12 loài VKL nước ngọt. Các tác giả này thu được ba nhóm kết quả khác nhau như ức chế mạnh lên sinh trưởng cả ba lồi VKL độc nước ngọt trong đó có lồi M. aeruginosa, nhưng lại kích thích sinh trưởng hoặc không thể hiện ảnh hưởng ức chế lên đối tượng khác. Triển khai với 6 mẫu nước hồ tự nhiên, Ferrier và cộng sự cho rằng khơng có sự khác biệt giữa mẫu đối chứng và mẫu thực nghiệm và kết luận rằng dịch chiết của rơm lúa mạch khơng có hiệu quả để kiểm sốt bùng nổ sinh khối TVN trong các hệ sinh thái [81].

24

Năm 2009, Timothy tiến hành thực nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng lên sinh trưởng VKL độc M. aeruginosa của 3 loại cao chiết nước từ rơm lúa mạch được tạo ra ở các điều kiện khác nhau về dung môi và thời gian ngâm chiết [82]. Kết quả cho thấy cả ba loại cao chiết đều vẫn thể hiện sự ức chế lên M. aeruginosa với nồng độ rất cao là 1720, 2400 và 3030 mg/L. Tác giả cho rằng thời gian ngâm và dung môi

chiết khơng làm ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của dịch chiết, đồng thời khẳng định vai trị của các hợp chất phenolic với khối lượng phân tử dao động từ 1000 đến 3000 Da trong hiệu quả diệt VKL. Mặc dù rơm lúa mạch là đối tượng được nghiên cứu chi tiết và toàn diện nhất trong một thời gian dài bởi nhiều nhà khoa học khác nhau, nhưng các kết quả nghiên cứu được cơng bố cịn chưa có sự thống nhất về hoạt tính ức chế lên M. aeruginosa, chưa đưa ra sự giải thích thỏa đáng về cơ chế tác động của cao chiết lên tế bào VKL cũng như những ảnh hưởng đến các thơng số thủy hóa và thủy lý của mơi trường.chưa được nghiên cứu.

1.2.2.2. Cao chiết từ rơm lúa gạo Oryza sativa

Rơm lúa gạo cũng là một đối tượng được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu như một tác nhân phòng chống bùng nổ VKL độc, đặc biệt là ức chế sinh trưởng

M. aeruginosa. Park và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết metanol của

rơm lúa gạo lên sinh trưởng của M. aeruginosa với các nồng độ khác nhau từ 0,1

đến 10 mg/L, đồng thời đánh giá hoạt tính diệt tảo của 7 hợp chất hóa học (nồng độ 0,01 và 0,1 mg/L) được phân lập từ rơm trong 8 ngày thực nghiệm [75]. Kết quả chứng minh hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết lên đến 98 % tại nồng độ 10 mg/L và axit salicylic có hoạt tính diệt tảo cao nhất so với các chất còn lại, sự trộn lẫn các hợp chất ví dụ như axit p-coumaric, axit salicylic và axit benzoic với nồng độ 0,01 mg/L gây ức chế đến 60 %, cao hơn hẳn so với sự ức chế sinh trưởng VKL của từng chất riêng lẻ. Sự ảnh hưởng của cao chiết lên các tế bào VKL ở dạng đơn lẻ mạnh mẽ hơn khi VKL tồn tại dưới dạng các tập đoàn M. aeruginosa [83].

Về tính an tồn sinh thái khi sử dụng cao chiết rơm như hoạt chất diệt tảo, Park và cộng sự đã chứng minh cao chiết O. sativa thể hiện sự ức chế có chọn lọc lên lồi VKL độc so với các lồi khác khơng thuộc đối tượng tác động như tảo lục (Ankistrodesmus convolutus và Scenedesmus quadricauda) và giáp xác (Daphnia

25

magna) thể hiện tính thân thiện và hứa hẹn sử dụng như một hoạt chất diệt tảo tiềm

năng [84]. Các hoạt chất hóa học phân lập từ cao chiết của O. sativa cũng được các nhà khoa học quan tâm và đánh giá hiệu quả ức chế lên M. aerugionsa. Ateeque và cộng sự đã thử nghiệm 5 chất sạch (nồng độ 1, 10 và 100 mg/L) lên sinh trưởng của

M. aeruginosa và ghi nhận hiệu quả ức chế cao nhất 92,6 % tại nồng độ 100 mg/L

của hoạt chất oleioyl-β-D-arabinoside sau 6 ngày thực nghiệm [85]. Tuy nhiên kết quả triển khai thử nghiệm cao chiết rơm lúa gạo lên các mẫu nước hồ tự nhiên cũng như triển khai thử nghiệm quy mơ ngồi trời cũng chưa được cơng bố. Các tác giả cũng chưa đưa ra được cơ chế tác động của cao chiết rơm lúa mạch cũng như của các hoạt chất lên sinh trưởng của M. aeruginosa.

1.2.2.3. Cao chiết nước từ các loài cây họ Anh túc Papaveraceae

Mặc dù nghiên cứu về hiệu quả sử dụng cao chiết từ các loài cây họ

Papaveraceae lên sinh trưởng M. aeruginosa không được nhiều nhà khoa học quan

tâm như hai đối tượng trên, tuy nhiên kết quả nghiên cứu khả quan và toàn diện của

Jancula và cộng sự năm 2007 [55] trở thành một ví dụ tiêu biểu cho phương pháp ứng dụng cao chiết thực vật để kiểm soát sự bùng nổ thực vật phù du nói chung và sinh trưởng M. aeruginosa nói riêng trong các hệ sinh thái nước ngọt. Cao chiết nước của rễ 5 lồi cây Anh túc có khả năng kiểm soát tốt quá trình sinh trưởng của M. aeruginosa với giá trị EC50 dao động từ 57,11 đến 870,92 mg/L, trong đó là hai lồi Dicranostigma lactucoides (EC50 55,81 mg/L) và Chelidonium majus (EC50 57,11 mg/L) có tính kháng VKL tốt nhất tiếp theo là các loài Sanguinaria canadensis (EC50 122,01 mg/L, Stylophorum lasiocarpum (EC50 161,69 mg/L) và Macleaya microcarpa (EC50 870,92 mg/L).

Để đánh giá độ an toàn sinh thái khi sử dụng cao chiết như hoạt chất diệt tảo cụ thể nghiên cứu sự tác động của cao chiết lên các loài sinh vật khác, hai loài tảo

Pseudokirchneriella subcapitata và Scenedesmus quadricauda, động vật phù du Daphnia magna và bèo tấm Lemna minor được lựa chọn. Đây là những loài sinh vật

có lợi rất nhạy cảm với sự ơ nhiễm của môi trường và là đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá độc chất. Trong 5 loại cao chiết từ 5 loài cây họ Anh túc

26

chúng lên tảo P. subcapitata, S. quadricauda thấp hơn so với VKL với giá trị EC50 ghi nhận là 60,87 và 78,01 mg/L [84]. Cao chiết C. majus cũng ít độc hơn lên D. magna với giá trị EC50> 500 mg/L sau 24 và 48 giờ phơi nhiễm và ít độc hơn lên L. minor với giá trị EC50 là 448,69 mg/L.

Dựa vào các kết quả nghiên cứu trên, Jancula và cộng sự đã lựa chọn cao chiết từ C. majus để triển khai thử nghiệm với mẫu nước đầm thực tế trong điều kiện tự nhiên để đánh giá ảnh hưởng ức chế của các cao chiết này lên nhóm TVN trong đó

Actinastrum sp., Dictyosphaerium sp., Mougotia sp., Nitzschia sp., Planktothrix

agardhii là những loài chiếm ưu thế. Sau 10 ngày thí nghiệm, tính theo phương pháp

đo hàm lượng chlorophyll a, giá trị EC50 của cao chiết lên thực vật phù du là 87,71 mg/L, cao hơn với giá trị EC50 trên VKL và vi tảo. Để giải thích nguyên nhân gây ra sự ức chế sinh trưởng của cao chiết các loài cây Họ Anh túc lên VKL, nhóm tác giả đã tiến hành phân tích thành phần và tỉ lệ các alkaloids có trong 5 loại cao chiết. Thực nghiệm cho thấy magnoflorine và coptisine được tìm thấy với tỉ lệ cao nhất trong cao chiết của C. majus với hiệu suất là 0,345 và 1,372 % theo sinh khối khô. Các hợp chất enzo[c]phenanthridine alkaloids này có thể là nguyên nhân gây ra khả năng ức chế sinh trưởng M. aeruginosa.

Mặc dù nhóm tác giả đã lựa chọn được cao chiết C. majus trong 5 cao chiết thử nghiệm vì tiềm năng diệt VKL độc và an tồn đối với các lồi khác trong mơi trường, đã phân tích thành phần hóa học để giải thích hoạt tính diệt khuẩn của các cao chiết này, tuy nhiên tác giả chưa đánh giá được ảnh hưởng của cao chiết đến các thông số môi trường khi áp dụng ở quy mô nước đầm hồ tự nhiên, chưa đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên siêu cấu trúc tế bào M. aeruginosa để đưa ra cơ chế giải thích ảnh hưởng của cao chiết phù hợp.

1.2.2.4 . Cao chiết từ cây keo Acacia mearnsii

Năm 2012, Zhou và cộng sự nghiên cứu cao chiết từ cây keo đen để kiểm soát sự bùng nổ VKL và các loài thực vật phù du trong mẫu nước hồ thực tế [86]. Mơ hình nghiên cứu được triển khai dưới hai hình thức – mơ hình thí nghiệm thời gian ngắn – đánh giá vai trò của cao chiết ức chế bùng nổ VKL trong trường hợp khẩn cấp (1 tháng) và mơ hình thí nghiệm thời gian dài (1 năm) - đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên chất lượng môi trường nước cũng như hiệu quả kiểm soát bùng nổ vi tảo độc

27

trong thời gian dài. Kết quả chỉ ra rằng, trong mơ hình thí nghiệm ngắn, bổ sung 3,623 mg/L cao chiết một lần duy nhất trong ngày đầu tiên dẫn đến sự giảm đáng kể mật độ tế bào và hàm lượng chlorophyll a của VKL sau thời gian 17 ngày. Hiệu quả ức chế giảm dần, sau 11 ngày hiệu quả ức chế là 59 % và giảm xuống còn 38% sau ngày thứ 14 thực nghiệm. Theo tác giả điều này có liên quan đến việc tự phân hủy của các cao chiết theo thời gian. Nồng độ lúc đầu của cao chiết cây keo đen trong nước sạch là 2 mg/L sau 3 ngày tốc độ phân hủy sinh học là 26 %, sau 6 ngày là 45 %, đến ngày thứ 15 là 80 %. Trong mơ hình thí nghiệm thời gian dài, cao chiết được bổ sung hằng tuần 1-2 mg/L để đảm bảo cao chiết có trong mẫu trong suốt q trình thực nghiệm. Kết quả cho thấy cao chiết có khả năng kiểm soát bùng nổ VKL độc rất hiệu quả đặc biệt là ở những giai đoạn đầu.

Ngoài ra ảnh hưởng lên các loài động vật phù du và thực vật phù du cũng được nghiên cứu đồng thời. Trong giai đoạn đầu có sự tăng rất mạnh sinh khối của các chủng tảo đặc biệt chiếm ưu thế của Pseudanabaenaceae, Cryptophyceae và Navicula, sau đó mật độ tế bào giảm dần. Sau hai tuần bổ sung cao chiết vào mẫu nghiên cứu, các loài động vật phù du cỡ nhỏ (< 1mm) cũng suy giảm mạnh số lượng chỉ còn bằng 2,4 % so với số lượng ban đầu. Tuy nhiên các loài động vật phù du cỡ lớn lại gia tăng

mạnh sinh khối, đặc biệt bộ Calanoida chiếm ưu thế, tăng đến 681% tại thời điểm cuối thực nghiệm. Các thông số của môi trường cũng bị ảnh hưởng bởi cao chiết thực vật, đặc biệt là giá trị pH.

1.2.2.5. Cao chiết từ rễ cây Ephedra equisetina

Yan cho rằng cao chiết nước rễ cây E. equisetina ức chế có hiệu quả lên sinh

trưởng của thực vật phù du trong đó lồi M. aeruginosa chiếm ưu thế [59]. Ở mẫu đối chứng, hàm lượng chlorophyll a tăng lên từ 670 đến 1360 µg/L trong khi ở các mẫu thực nghiệm có bổ sung cao chiết (nồng độ 10, 25, 50 và 75µg), giá trị này giảm dần từ 670 xuống 150 µg/L sau 5 ngày thực nghiệm. Ảnh hưởng của cao chiết đến

chất lượng nước hồ tự nhiên, đặc biệt lên các thơng số thủy hóa, khơng thấy có sự khác biệt lớn giữa mẫu đối chứng và thực nghiệm (p>0,05): giá trị trung bình ghi nhận nitơ tổng (TN) (6,45 mg/L), photpho tổng (TP) (0,65 mg/L), tổng photphat hòa

28

tan (TDP) (0,23 mg/L), hàm lượng nitrat (NO3-N) (1,77 mg/L) và hàm lượng amoni (NH4-N) là 2,69 mg/L.

Nhóm tác giả cũng đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên quần thể cá trong mẫu nước hồ tự nhiên. Dưới tác động của cao chiết, tỉ lệ sống sót và sinh sản của cá giữa mẫu đối chứng và thực nghiệm khơng có sự khác biệt lớn (p<0,05). Quan sát tương tự trên đối tượng động vật phù du, thực vật bậc cao và vi khuẩn, mật độ tế bào của các lồi cịn cao hơn so với mẫu đối chứng mà nguyên nhân theo tác giả là từ việc giảm mật độ của M. aeruginosa, cũng như giảm nồng độ độc tố microcystin khi sử dụng cao chiết dẫn đến làm sạch, trong môi trường nước taọ điều kiện cho các loài khác phát triển. Ngoài ra, chỉ số đa dạng các loài cũng chứng minh rằng hệ sinh thái thủy sinh phục hồi đến một trạng thái tương đối ổn định và khỏe mạnh sau khi xử lý bằng cao chiết E. equisetina. Thử nghiệm ảnh hưởng của cao chiết từ E. equisetina

lên sinh trưởng của M. aeruginosa dưới ánh sáng (8000 ± 200 lux) và nhiệt độ cao (350C) trong 7 ngày. Kết quả không quan sát thấy sự khác biệt giữa các mẫu thực nghiệm và mẫu đối chứng (p>0,05). Điều đó chứng minh rằng các hoạt chất trong cao chiết có tác dụng diệt M. aeruginosa đã bị phân hủy dưới điều kiện ánh sáng và nhiệt độ cao. Đặc biệt đối với các hoạt chất có nhóm hydroxyl gắn với C-3 của vòng benzene.

Sau khi bổ sung cao chiết, đã quan sát thấy xác tế bào VKL lắng đọng ở đáy bình thí nghiệm. Dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), các thành tế bào của

M. aeruginosa vẫn còn nguyên vẹn trong cả mẫu đối chứng và mẫu thực nghiệm. Tuy

nhiên, trong các mẫu thực nghiệm, màng thylakoid bị tách ra khỏi tế bào chất của VKL. Các cấu trúc bên trong màng thylakoid bắt đầu bị tổn thương. Điều này gợi ý rằng cái chết của VKL là do ''tấn cơng hóa học'' bởi các hợp chất flavonoid trong cao chiết đã đi qua màng tế bào gây tổn thương bên trong hơn là tác động tổn thương về mặt cơ học như các tia UV.

1.2.2.6. Cao chiết từ các cây thuộc họ Myriophyllaceae

Nakai và cộng sự đã phân lập các hoạt chất từ cao chiết cây M. spicatum và đánh giá ảnh hưởng của chúng lên sinh trưởng của M. aeruginosa [87]. Nhóm tác giả phân lập được các hợp chất polyphenol như axit gallic (EC50 1,0 mg/L) và axit