CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2.Thực nghiệm nghiên cứu độc tính diệt VKL độc và tảo lục của các cao chiết
2.4. Mô tả thực nghiệm
2.4.2.Thực nghiệm nghiên cứu độc tính diệt VKL độc và tảo lục của các cao chiết
Thí nghiệm đánh giá tác động ức chế của cao chiết Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và Ch. vulgaris quy mơ phịng thí nghiệm được tiến hành tại Phịng
Thủy Sinh học môi trường, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đầu tiên các chủng M. aeruginosa TC3 và Ch. vulgaris được nuôi và nhân tăng sinh khối theo phương pháp của Shirai (1989) trong các bình tam giác (250 mL) chứa 150 mL môi trường CB hoặc môi trường Sorokin và Krauss với nhiệt độ ổn định 250C, ánh sáng huỳnh quang cường độ 1000 lux chu kỳ 12 giờ sáng/12 giờ tối.
Hình 2.15. Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các cao chiết từ cây Mần tưới lên sinh trưởng M. aeruginosa và Ch. vulgaris
Để đánh giá tác động ức chế của cao chiết cây Mần tưới lên M. aeruginosa
hoặc Ch. vulgaris, các thí nghiệm được bố trí như sau: đầu tiên các cao chiết được hịa tan vào dung mơi DMSO hoặc dung môi etanol tạo nồng độ gốc ban đầu 10 mg/mL, thể tích dung mơi DMSO và etanol sử dụng đảm bảo nồng độ dung môi trong môi trường nuôi nghiên cứu nuôi VKL hoặc Ch.vulgaris nhỏ hơn 1% về thể
63
tích sẽ khơng gây độc của cho các lồi [135]. Sau đó các mẫu cao chiết được bổ sung vào bình Erlen dung tích 250 mL có chứa các tế bào VKL M. aeruginosa hoặc
Ch. vulgaris (với mật độ tế bào ban đầu ≈ 3 × 105 TB/mL) theo các nồng độ nghiên cứu tương ứng từ 50 đến 500 µg/mL, đồng thời theo dõi song song mẫu đối chứng (mẫu chứa VKL M. aeruginosa hoặc Ch. vulgaris nuôi trong môi trường dinh dưỡng cùng điều kiện nhưng không bổ sung cao chiết) và hợp chất CuSO4 nồng độ 5 µg/mL –mẫu đối chứng dương. Các cơng thức thí nghiệm được bố trí ba lần lặp lại, theo dõi liên tục trong 10 ngày, lấy mẫu theo chu kì sau: T0 (ngày đầu tiên), T3 (sau 3 ngày), T6 (sau sáu ngày) và T10 (sau 10 ngày). Mẫu sau khi thu, mẫu được xử lý và đánh giá bằng các phương pháp khác nhau như đo mật độ quang, phân tích hàm lượng chlorophyll a và đếm mật độ tế bào. Từ thực nghiệm sẽ lựa chọn ra dung mơi phù hợp, xây dựng quy trình để tạo cao chiết hiệu quả với số lượng lớn phục vụ cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
Xác định hoạt tính diệt VKL độc M. aeruginosa của các chất sạch phân lập từ cao chiết Mần tưới được triển khai trong các lọ thủy tinh thể tích 25 mL. Các tế bào được nuôi trong môi trường dinh dưỡng CB (với mật độ tế bào ban đầu ≈ 14 × 105 TB/mL) có bổ sung thêm các chất sạch theo dải nồng độ từ 1, 10, 20 và 50 µg/mL. Tác dụng của chất sạch lên sinh trưởng của VKL độc sau 72 giờ phơi nhiễm được xác định thông qua đo mật độ quang ở bước sóng 680 nm trên máy đọc đĩa 96 giếng và phương pháp đếm mật độ tế bào tại thời điểm bắt đầu (T0) và sau 72 giờ (T72).
64
Hình 2.16. Thực nghiệm đánh giá hoạt tính diệt VKL độc của các chất sạch tách chiết từ cây Mần tưới