CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.3.Thực nghiệm đánh giá tính an tồn của cao chiết
2.4. Mô tả thực nghiệm
2.4.3.Thực nghiệm đánh giá tính an tồn của cao chiết
2.4.3.1. Đánh giá độc tính của cao chiết Mần tưới lên giáp xác (Daphnia magna)
Đánh giá độc tính của cao chiết tổng etanol và cao chiết phân đoạn etyl axetat từ cây Mần tưới lên động vật Giáp xác (Daphnia magna) được tiến hành tại Khoa Môi trường và Tài nguyên thuộc Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh. Lồi D. magna được cung cấp bởi công ty Microbiotests Inc (Bỉ) và nuôi trong môi trường COMBO (Kilham,1990) ở điều kiện nhiệt độ ổn định 22 ± 0.5 oC với cường độ chiếu sáng 800 lux và chu kì 16 giờ sáng: 8 giờ tối. Môi trường và thức ăn cho Daphnia là Ch. vulgaris được bổ sung và thay mới định kì 2 ngày một lần cho tới khi đủ số lượng
cho nghiên cứu. 10 cá thể Daphnia 1 ngày tuổi được lựa chọn ngẫu nhiên. Một lô đối chứng (không cho hoạt chất CuSO4 hoặc cao chiết vào) được tiến hành song song để so sánh. Đối với mỗi hoạt chất (CuSO4 hoặc cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn Mần tưới) tác giả bố trí 1 lơ đối chứng (không cho CuSO4 hay cao chiết vào). Mỗi công thức thực nghiệm được lặp lại 4 lần (n = 4) kí hiệu A1 – A4.
65
Trong mỗi bình chứa 40 mL mơi trường ni D. magna bổ sung vào 10 con D.
magna non (< 24h tuổi). Các giá trị pH và DO được đo trong từng lơ thí nghiệm khi bắt
đầu và kết thúc thí nghiệm để đảm bảo 2 yếu tố này khơng ảnh hưởng xấu lên sinh vật. Độc tính của cao chiết đến D. magna được tính bằng tỷ lệ số lượng con sống/con chết (hoặc con chết/tổng số con) trong sau 24 giờ và 48 giờ tác động. Kết quả thu được tính tốn dựa vào phần mềm Probit – SPSS 23 để ước tính giá trị LC50.
2.4.3.2. Đánh giá độc tính của cao chiết Mần tưới lên bèo tấm (Lemna minor)
Đánh giá độc tính của cao chiết Mần tưới lên bèo tấm (Lemna minor) được tiến hành tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Bèo tấm được thu nhận từ một số thủy vực tự nhiên tại Cổ Nhuế, Từ Liêm, Hà Nội, sau đó được đưa về phịng thí nghiệm để lựa chọn những cây bèo khỏe mạnh, kích thước và số lá đồng đều nhau. Đầu tiên các cây bèo được nuôi trong môi trường dinh dưỡng Hoagnlan [132] (ISO 20079, 2005), điều kiện nhiệt độ phịng thí nghiệm ổn định 25 ± 0,5 0C và cường độ chiếu sáng là 1000 lux với chu kỳ 16 giờ sáng: 8 giờ tối. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh đến pH 6,5 trước khi tiến hành hấp thanh trùng. Cần 3-4 tuần nuôi cấy trong điều kiện như trên để bèo thích nghi với mơi trường trong phịng thí nghiệm.
Hình 2.18. Thực nghiệm nghiên cứu mẫu bèo Lemna minor dưới ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới
Lựa chọn từ đó 6 cá thể bèo 3 cánh, cây bèo khỏe mạnh và đồng đều nhau về kích thước cho vào cốc thủy tinh 250 mL có chứa 150 mL dung dịch Hoagnlan, sau đó bổ sung cao chiết theo nồng độ nghiên cứu để đánh giá độc tính. Mỗi cơng thức
66
thí nghiệm được lặp lại 5 lần (n=5) và theo dõi liên tục trong 5 ngày. Bên cạnh các mẫu thực nghiệm bổ sung cao chiết, bố trí song song mẫu đồng sunphat (CuSO4) nồng độ 5 µg/mL và mẫu đối chứng chỉ chứa mơi trường dinh dưỡng và đối tượng bèo nghiên cứu.
Để đánh giá độc tính của cao chiết thực vật lên bèo, số cánh bèo được đếm hằng ngày từ ngày T0 (ngày đầu) đến T5 (ngày cuối), đồng thời so sánh sự thay đổi sinh khối tươi của bèo tại thời điểm T0 và T5, so sánh sự khác nhau về hình thái cánh bèo, hàm lượng chlorophyll a và chlorophyll b của mẫu thực nghiệm và mẫu đối chứng tại ngày T5.