68
3.1. Công thức cấu tạo các chất sạch được tách chiết từ cây Mần tưới Eupatorium
fortunei
Tại Việt Nam, Mần tưới cùng nhiều loài thực vật khác đã được khảo sát ảnh hưởng ức chế lên sinh trưởng của M. aeruginosa và Ch. vulgaris [2, 3]. Kết quả
thực nghiệm cho thấy những ưu điểm nổi bật của cao chiết tổng Mần tưới so với các lồi thực vật khác đó là khả năng ức chế chọn lọc lên VKL độc M. aeruginosa và tảo lục Ch. vulgaris. Hiệu suất tổng hợp cao chiết tổng methanol, cao chiết tổng nước của Mần tưới tương ứng được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Hiệu suất tạo cao chiết tổng trong các dung môi khác nhau
Dung Môi Hiệu suất tạo cao chiết tổng từ Mần tưới (g cao chiết/100g mẫu thực vật khô)
Etanol 9,17
Metanol 12,75
W (Nước) 7,75
Lý do tác giả luận án đã sử dụng cao chiết tổng etanol Mần tưới để triển khai chiết phân đoạn và tách chiết các chất sạch sẽ được giải thích trong mục 3.2.
Tiến hành chiết phân bố tạo với dung môi n-hexan, etyl axetat và nước thu
được cao chiết phân đoạn tương ứng theo hiệu suất được trình bày tại bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hiệu suất tạo cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng ethanol Mần tưới
Cao chiết phân đoạn Hiệu suât (%) từ cao chiết tổng
etanol Mần tưới
Cao chiết phân đoạn n-hexan 18,97
Cao chiết phân đoạn etyl axetate 16,10 Cao chiết phân đoạn nước (W) 60,27
69
Quy trình phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới
Hiệu suất phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl acetat Mần tưới được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hiệu suất tách chiết các chất sạch từ Mần tưới
STT Hợp chất Tỉ lệ mg chất sạch/100 g cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới
1. EfD5.1 71,69 2. EfD14.1 20,80 3. EfD1.8 13,34 4. EfD10.1 4,56 5. EfD10.3 3,91 6. EfD4.7 2,61 7. EfD4.8 1,56
Tác giả đã tách chiết được 7 chất sạch được kí hiệu EfD4.7; EfD4.8, EfD10.1; EfD1.8; EfD14.1, EfD5.1 và EfD10.3. Sau đây là kết quả xác định công thức cấu tạo và các đặc trưng khác liên quan của 7 chất sạch nói trên.
3.1.1. Hợp chất 7,8,9-trihydroxythymol (EfD4.7)
Hình 3.1. Cấu trúc hố học và các tương tác HMBC chính của chất EfD4.7
Cơng thức phân tử C10H14O4 của EfD4.7 được gợi ý là trên cơ sở sự xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 221,0783 [M + Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức phân tử C10H14NaO4, 221,0790) trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS.
70
Hình 3.2. Phổ HR-ESI-MS của chất EfD4.7
Trên phổ 1H NMR của hợp chất EfD4.7 xuất hiện tín hiệu đặc trưng của vòng thơm dạng ABX [δH 6,79 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,20 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5), and 6,81 (1H, dd, J = 7,5, 2,0 Hz, H-6)], một nhóm methyl singlet ở C-10 tại δH 1,58 (3H, s, H-10). Ngồi ra cịn có các tín hiệu của proton ở vùng trường trung bình δH 4,57; 3,74 và 3,65.
71
Phân tích dữ liệu phổ 13C NMR kết hợp với phổ HSQC nhận thấy có sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 10 cacbon, bao gồm 1 nhóm methyl (δC 26,1, C- 10), 2 nhóm oxymethylene tại δC 64,9 (C-7) và 72,4 (C-9), 1 cacbon bậc 3 mang nhóm hydroxy (δC 76,9, C-8) và một vịng thơm thế ABX [δC 140,1 (C-1); 116,3 (C-2); 156,8 (C-3); 133,5 (C-4); 129,5 (C-5); 120,7 (C-6)].
72
73
74
Các dữ liệu trên khẳng định hợp chất EfD4.7 có dạng khung thymol khá phổ biến trong chi Eupatorium [123]. Thực tế các số liệu 1H và 13C-NMR của EfD4.7 rất tương đồng với số liệu đã công bố của hợp chất 8,9-dihydroxythymol [136], ngoại trừ sự xuất hiện của nhóm hydroxymethyl thay vì nhóm methyl tại C-7. Phân tích trên phổ hai chiều HMBC cũng đã chỉ ra các tương tác từ H-7 (δH 4,52) đến C-1, C-2 và C-6, từ H-9 (δH 3,76 và 3,65) đến C-4, C-8 và C-10, và từ H-10 (δH 1,58) đến C-4, C- 8 và C-9. Như vậy có thể kết luận hợp chất EfD4.7 là 7,8,9-trihydroxythymol, một hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập.
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hai chất EfD4.7 và EfD4.8:
STT EfD4.7 [CD3OD] EfD4.8 [CD3OD] δH (m, J in Hz) δC δH (m, J in Hz) δC 1 140,1 - 143,6 2 6,79 (1H, d; 2,0) 116,3 6,82 (1H, d; 2,0) 115,1 3 - 156,8 - 155,8 4 - 133,5 - 127,8 5 7,20 (1H, d, 7.5) 129,5 7,12 (1H, d; 7,5) 131,1 6 6,81 (1H, dd; 7,5; 2,0) 120,5 6,80 (1H, dd; 7,5; 2,0) 119,0 7 4,52 (2H, s) 64,9 4,55 (2H, s) 64,8 8 - 76,9 - 149,3 9 3,76 (1H, d; 11,0) 3,65 (1H, d; 11,0) 72,4 4,39 (2H, s) 65,8 10 1,58 (3H, s) 26,1 5,41 (1H, d; 2,0) 5,20 (1H, d; 2,0) 114,8
75
3.1.2. Hợp chất 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol(EfD4.8)
Hình 3.7. Cấu trúc hố học và các tương tác HMBC chính của chất EfD 4.8
Phổ 1H và 13C-NMR của EfD4.8 rất tương đồng với phổ của EfD4.7 ngoại trừ sự xuất hiện của 1 nhóm methylene ngoại vịng (δC/δH 114,8/5,41 and 5,20) thay vì nhóm methyl C-10 như chất EfD4.7. Điều này cũng được khằng định dựa vào số liệu phổ khối lượng phân giải cao. Công thức phân tử C10H13O2 của EfD4.8 được xác định dựa trên pic ion giả phân tử tại m/z 181.0864 [M + H]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức phân tử C10H14O2,181.0865) trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS. Các tương tác HMBC (Hình 3.12) cũng khẳng định cấu trúc của hợp chất EfD4.8
76
Hình.3.9. Phổ 1H NMR của chất EfD4.8
77
78
79
3.1.3. Hợp chất 8,9,10- Trihydroxythymol (EfD5.1)
Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất EfD5.1
Phổ 1H NMR trên vùng trường yếu xuất hiện 3 tín hiệu proton của vịng thơm tại H 6,57 (2H, br d, H-2, 6); 6,79 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5), dịch về vùng trường mạnh xuất hiện tín hiệu chập của hai nhóm methylene tại H 3,74 (4H, s, H-9, 10), và cịn lại là một tín hiệu của nhóm methyl tại H 2,16 (3H, s, H-7).
Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H NMR (H và J) của EfD 10.1 và của hợp chất 8,9,10-
Trihydroxythymol đã được công bố trong tài liệu tham khảo [137]
Proton EfD 5.1 [CD3OD] 8,9,10- Trihydroxythymol [CD3OD] [137] H J (Hz) H J (Hz) H2 (1H, d) 6,57 - 6,59 1,7 H5 (1H, d) 6,79 7,5 7,17 7,8 H6 (2H, br d) 6,57 - 6,64 (1H,dd) 7,8 và 1,7 H7 (3H, s) 2,16 - 2,20 - H9 (4H, s) 3,74 - 3,88 (1H, s) 12,0 H10 (4H, s) 3,74 - 3,85 (1H, s) 12,0
Qua những phân tích trên, so sánh với giá trị H và Rf của hợp chất 8,9,10-
trihydroxythymol đã công bố (bảng 3.5) kết luận được hợp chất EfD5.1 là 8,9,10- trihydroxythymol.
80
3.1.4. Hợp chất o-Coumaric acid (EfD1.8)
Hình 3.14. Cấu trúc hợp chất EfD1.8
Hợp chất EfD1.8 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H NMR trên vùng trường yếu xuất hiện 6 tín hiệu proton sp2, trong đó có 4 tín hiệu proton của vòng thơm tại H 6,83 (1H, br d, H-5); 6,86 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-3); 7,21 (1H, br d, H-4) và 7,49 (1H, br d, H-6) và hai tín hiệu proton của liên kết đôi tại H 6,57 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-8); 7,99 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-7). Phổ 13C NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy hợp chất chứa 9 tín hiệu các nguyên tử cacbon trong đó bao gồm 6 nhóm methine và 3 nguyên tử carbon không chứa hydro. Sáu tín hiệu của vịng thơm tại C 122,6 (C-1); 158,1 (C-2); 118,6 (C-3); 132,5 (C-4); 120,7 (C-5) và 129,9 (C-6). Hai tín hiệu của liên kết đơi tại C 142,4 (C-7)/116,9 (C-8) và một tín hiệu của nhóm carboxylic tại C 171,3 (C-9). Tại liên kết đơi, hai proton có hằng số tương tác khá cao (J = 16,5 Hz) nên liên kết đơi này có cấu hình trans.
Bảng 3.6. Số liệu phổ 13C NMR của hợp chất axit o- coumaric
STT
Giá trị δ (ppm) Tài liệu tham khảo [138]
[DMSO] Thực nghiệm [CD3OD] C1 120,97 122,66 C2 156,64 158,16 C3 118,30 118,63 C4 131,47 132,53 C5 119,45 120,76 C6 128,72 129,98 C7 168,13 142,49 C8 116,18 116,99 C9 139,65 171,30
81
Bảng 3.7. Số liệu phổ 1H NMR của hợp chất axit o- coumaric
STT
Giá trị δ (ppm) Tài liệu tham khảo
[DMSO] [138] Thực nghiệm [CD3OD] H1 - - H2 - - H3 6,90 6,86 H4 7,21 7,21 H5 6,82 6,85 H6 7,56 7,49 H7 6,51 6,57 H8 7,82 7,99
Với những phân tích trên và so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố xác định được hợp chất EfD1.8 là o-coumaric axit [138, 139]. Axit o- coumaric được tìm thấy ở rất nhiều các loài thực vật khác như Eupatorium adenophorum, Mikania
laevigata Sch.Bip. ex Baker (Compositae), Mikania glomerata Spreng, Medicago sativa L. (Leguminosae), Caucalis platycarpos L. (Apiaceae) và Urtica urens, Mikania laevigata [140, 141]. Những nghiên cứu trước đã chứng minh rằng axit o
-coumaric có hoạt tính sinh học khác nhau như tính kháng khuẩn, chống đơng máu, chống oxy hóa, chống ung thư và còn ức chế sự nảy mầm của hạt [142]
3.1.5. Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)benzaldehyde (EfD10.1)
Hình 3.15. Cấu trúc hợp chất EfD10.1
Hợp chất EfD10.1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H NMR vùng trường rất yếu xuất hiện một tín hiệu đặc trưng của nhóm aldehyde tại H
9,70 (1H, s, -CHO), trên vùng trường yếu là xuất hiện hai tín hiệu chập của proton thơm (aromatic) tại H 7,04 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, 6); 7,33 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, 5). Vùng trường mạnh hơn xuất hiện hai tín hiệu hai nhóm methylene tại H
82
2,74 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-7a) và 3,71 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-7b), tín hiệu có giá trị cao hơn giá trị của nhóm methylene bình thường tại H 3,71 do nhóm này liên kết trực tiếp với nguyên tử hút điện mạnh oxy. Phổ 13C-NMR vùng trường mạnh xuất hiện tín hiệu của nhóm methylene tại C 39,3 (C-7), dịch về phía vùng
trường yếu hơn cũng xuất hiện tín hiệu của nhóm methylene nhưng có giá trị cao hơn nhóm methylene thơng thường do nhóm này liên kết trực tiếp với nguyên tử mang độ âm điện lớn là oxy tại C 64.5 (C-8). Trên phổ 13C-NMR cũng xuất hiện 4 tín hiệu của 6 cacbon hệ vịng thơm tại C 147,2 (C-1); 116,1 (C-2, 6); 130,8 (C-3, 5); 141,7 (C-4). Ngồi ra cịn tín hiệu của nhóm aldehyde tại C 193,0. Với những phân tích dữ liệu phổ trên và so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố xác định được hợp chất EfD10.1 là 4-(2-hydroxyethyl) benzaldehyde [143].
3.1.6. Hợp chất kaempferol (EfD10.3)
Hình 3.16. Cấu trúc hợp chất EfD10.3
Hợp chất EfD10.3 thu được dưới dạng chất bột màu vàng. Phổ 1H NMR trên vùng trường yếu xuất hiện 2 cặp tín hiệu proton chập của vòng thơm hệ A2B2 tại H 6,93 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3ʹ, 5ʹ); 8,12 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2ʹ, 6ʹ), dịch về vùng trường mạnh xuất hiện 2 tín hiệu proton thơm khác trong vịng thơm ở vị trí meta với nhau tại H 6,20 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6); 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8).
83
Bảng 3.8. Số liệu phổ 1H NMR (H và J) của EfD 10.3 và của kaempferol đã được công bố EfD 10.3 [CD3OD] Kaempferol [CD3OD][137] H (ppm) J(Hz) H (ppm) J (Hz) H2’-6’ 8,12 (2H, d) 8,0 8,04 9,0 H3’-5’ 6,93 (2H, d) 8,0 6,92 9,0 H6 6,20 (1H, d) 1,5 6,19 1,8 H8 6,42 (1H, d) 1,5 6,44 1,8
Với những phân tích dữ liệu phổ trên và so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố của hợp chất kaempferol xác định được hợp chất EfD10.3 là kaempferol [144]. Hợp chất này được tìm thấy từ các nguồn thực vật khác nhau ví dụ như từ cây P. vittata L hoặc từ lá cây Urena lobata L thuộc họ Malvaceae. Từ lâu những loài cây chứa hàm lượng cao kaempferol luôn được sử dụng như những loại thuốc dân gian chữa sưng, viêm khớp [145].
3.1.7. Hợp chất 8,10-dihydroxy-9-acetoxythymol (EfD14.1)
Hình 3.17. Cấu trúc hợp chất EfD14.1
Hợp chất EfD14.1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H NMR trên vùng trường yếu xuất hiện 3 tín hiệu proton của vịng thơm tại H 6,61 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-2); 6,66 (1H, dd, J = 1,0; 8,0 Hz, H-6); 7,19 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), dịch về vùng trường mạnh xuất hiện 4 tín hiệu của hai nhóm methylene tại H 3,85 (1H, d, J = 11,5 Hz, Ha-9), 3,90 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-9); 4, 46 (1H, d, J = 11,5 Hz, Ha-10), 4,54 (1H, d, J = 11,5
84
Hz, Hb-10), và cịn lại là một tín hiệu của nhóm methyl tại H 2,25 (3H, s, H-7) và một nhóm acetyl tại H 2,00 (3H, s, CH3CO-). Qua những phân tích trên, so sánh với phổ 1H NMR của hợp chất 8,9-didydroxy -9 axetoxythymol đã được công bố [137] kết luận được hợp chất EfD14.1 là 8,9-didydroxy-9 axetoxythymol.
Bảng 3.9. Giá trị 1H NMR spectra (Hvà J) của EfD 14.1 với 8,9-didydroxy -9 axetoxythymol đã được công bố
EfD 14.1 [CD3OD] 8,9-didydroxy -9 axetoxythymol [CD3OD] H (ppm) J (Hz) H (ppm) J (Hz) 3H, 2,00 s- CH3CO - 1,98 - H2 6,61(1H, d) 1,0 6,61 1,7 H5 8,0(1H, d) 8,0 7,17 8,0 H6 6,66(1H, dd) 1,0 và 8,0 6,64 1,7 và 8,0 H7 2,25(3H, s) - 2,23 - Ha9 3,85(1H, d) 11,5 3,85 11,4 Hb9 3,90(1H, d) 11.5 3,90 11,4 Ha10 4,46(1H, d) 11,5 4,46 11,4 Hb10 4,54(1H, d) 11,5 4,54 11,4
Nhận xét những kết quả đạt được của Phần 3.1.
1. Đã xây dựng được quy trình tạo cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn quy mơ phịng thí nghiệm. Hiệu quả chiết mẫu cao tổng Mần tưới trong các dung môi metanol, etanol và nước lần lượt là 12,75; 9,17 và 7,75 %.
2. Đã xây dựng được quy trình tạo cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng etanol Mần tưới. Hiệu suất tạo cao chiết phân đoạn n-hexan, etyl axetat và cao chiết nước lần lượt là 18,97; 16,10 và 60,27%
3. Đã tách chiết được 07 chất sạch từ cao chiết etyl axetat Mần tưới trong đó 02 chất (7,8,9-trihydroxythymol và 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol) là chất mới chưa được công bố trong các tài liệu trước đây.
85
Cấu trúc phân tử của 7 hợp chất phân lập được từ cây Mần tưới E
.fortunei
7,8,9-trihydroxythymol (EfD4.7) 4-(2-hydroxyethyl)
benzaldehyde (EfD10.1)
8,10-didehydro-7,9- dihydroxythymol
(EfD4.8)
o-Coumaric acid (EfD1.8)
8,9-didydroxy -9 axetoxythymol
(EfD14.1) 8,9,10- Trihydroxythymol
86
Kaempferol (EfD10.3)
3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng và diệt VKL độc, vi tảo của các cao chiết và chất sạch được tách chiết các cao chiết và chất sạch được tách chiết
3.2.1. Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng VKL độc Microcystis aeruginosa của các cao chiết tổng Mần tưới
Nghiên cứu trước đây đã chứng minh cao chiết từ một vài lồi thực vật tại Việt Nam có khả năng ức chế sinh trưởng M. aeruginosa trong dải nồng độ 4 - 500 µg/mL và ghi nhận hiệu quả ức chế sinh trưởng cao nhất tại nồng độ 500 µg/mL đối với cao chiết metanol từ cây Mần tưới E. fortunei [2, 3]. Nghiên cứu này khảo sát và so sánh ảnh hưởng của các cao chiết tổng khác nhau từ cây Mần tưới (E-Eth, E-Me và E-W) thu được từ các dung môi tương ứng etanol, metanol và dung môi nước đến sự sinh trưởng của M. aeruginosa TC3 trong 10 ngày tại hai nồng độ 200 và 500 µg/mL với mật độ tế bào ban đầu 3 × 105 TB/mL. Động thái tăng trưởng sinh khối M. aeruginosa được theo dõi ở các ngày T0, T3, T6, và T10 bằng phương pháp đo mật độ quang tại bước sóng 680 nm và phân tích hàm lượng chlorophyll a [Hình 3.18]
Kết quả cho thấy các cao chiết được tạo ra từ các dung mơi khác nhau có ảnh hưởng ức chế lên M. aeruginosa khác nhau phụ thuộc vào thời gian và nồng độ
phơi nhiễm (p<0,05). Tại công thức đối chứng, các tế bào M. aeruginosa tăng dần theo thời gian (OD tại T0 là 0,03 ± 0,01) và đạt giá trị cao nhất tại ngày cuối (T10) (OD là 0,39 ± 0,01). Sự ức chế sinh trưởng của chủng M. aeruginosa được quan sát rõ nhất dưới ảnh hưởng của cao chiết etanol Mần tưới nồng độ 500 µg/mL với hiệu suất chế (IE) tính theo mật độ quang là 91,50 % cao hơn so với các cao chiết methanol (IE là 78,50) và cao chiết nước (IE là 61,72 %) (p<0,05). Hoạt chất CuSO4 5 µg/mL – mẫu đối chứng dương ghi nhận có giá trị tương đương với hiệu quả của cao chiết tổng metanol Mần tưới tại 500 µg/mL. Cao chiết tổng etanol tại
87
nồng độ 200 µg/mL và CuSO4 nồng độ 1 µg/mL có giá trị IE tương đương dao động từ 42,85 đến 48,56 %, cao hơn đáng kể so với cao chiết tổng metanol Mần tưới chỉ đạt IE là 5,12% (p<0,05). Ngược lại, cao chiết tổng nước từ cây Mần tưới lại kích thích nhẹ sinh trưởng M. aeruginosa ghi nhận mật độ quang tại ngày T10 là 0,43 ± 0,01 tương ứng với giá trị IE là -12,17%.
Hình 3.18. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng của M. aeruginosa tính theo mật độ quang (tại bước sóng 680 nm)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 T 0 T 3 T 6 T 1 0 Mậ t độ quang , ( λ= 680 nm) Thời gi an ( ngày) Control - M.a E- Eth-200 E- Me-200 E-W-200 CuSO4-1 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 T0 T3 T6 T10 Mậ t độ quang , ( λ= 680 nm)
Thời gian (ngày) Control- M.a E- Eth-500 E- Me-500 E-W-500 CuSO4-5 A B
88
Hình 3.19. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng của M. aeruginosa tính theo hàm lượng chlorophyll a
Tương tự phương pháp đo mật độ quang, kết quả phân tích hàm lượng chlorophyll a cho thấy sau khi bị phơi nhiễm với cao chiết, sinh trưởng của chủng
M. aeruginosa có sự khác biệt rõ rệt giữa mẫu đối chứng và các mẫu thực nghiệm,
đặc biệt là mẫu bổ sung cao chiết etanol và metanol Mần tưới (p< 0,05). Sinh khối trong mẫu đối chứng ngày T0 là 0,41 ± 0,05 µg/L tăng dần đến ngày kết
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 T 0 T 3 T 6 T 1 0 H àm lượng c hlor ophy ll a, µg /L T hờ i gi an ( ngày) Control- M.a E- Eth-200 E- Me-200 E-W-200 CuSO4-1 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 T0 T3 T6 T10