CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.5.Giáp xác Daphnia magna
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.5.Giáp xác Daphnia magna
Daphnia magna Straus có nguồn gốc từ công ty Microbiotests Inc (Bỉ), được cung cấp bởi PGS.TS Đào Thanh Sơn, Khoa Môi trường và Tài nguyên thuộc Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh, 268 Lý Thường Kiệt, Quận 10, TP Hồ Chí Minh.
Hình 2.6. Daphnia magna
Daphnia magna Straus được nuôi cấy trong môi trường ISO theo hướng dẫn
của APHA (2012) và được sử dụng làm sinh vật thí nghiệm đánh giá độc tính của các cao chiết.
50
Quần thể thực vật phù du hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng
Hình 2.7. Hồ Hồn Kiếm Hình 2.8. Hồ Láng
Hồ Hồn Kiếm hay cịn gọi là Hồ Gươm thuộc quận Hồn Kiếm nằm ở trung tâm thành phố Hà Nội [17], với diện tích bề mặt 0,12 km2, thể tích nước là 0,18 × 106 m3 , tọa độ N 21o 01’33’’, E 105o 51’11’’ [65, 133]. Hồ Láng thuộc quận Đống Đa, Hà Nội là những hồ nước ngọt tự nhiên nằm ở trung tâm thành phố có vai trị quan trọng trong sinh hoạt và điều hịa vi khí hậu. Trong những năm vừa qua do nhận nước thải nước thải (sinh hoạt và bệnh viện), hàm lượng dinh dưỡng cao cùng các điều kiện thuận lợi gây bùng nổ tảo trong đó có VKL độc đặc biệt vào tháng 3-4 và tháng 9-10 hằng năm.
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
Máy quay ly tâm; tủ lạnh bảo quản mẫu; máy đo quang , kính hiển vi quang học Olympus-BX51, Dụng cụ: bình tam giác 100, 500 mL, cốc thủy tinh 2L, phễu chiết, ống đong 50 mL, 100, 500 mL, bình cầu cất quay, giấy lọc; ống nghiệm thủy tinh 25mL
2.2.2. Hóa chất
Hóa chất dùng trong tổng hợp cao chiết thực vật bao gồm: nước cất, dung môi methanol (MeOH), etanol (EthOH), hexan, etyl axetat (EtOAc),
Hóa chất dùng trong ni cấy tế bào VKL và tảo lục (môi trường CB của Shirai): Ca (NO3)2. 4H2O; KNO3; MgSO4 .7H2O; 1-disodium glycerophosphate, FeCl3.6H2O; MnCl2 .4H2O; ZnSO4 .7H2O; CoCl2.6H2O; Na2MoO4. 2H2O; disodium EDTA. 2H2O,
51
NH4H2PO4, KNO3, Ca(NO3)2, MgSO4 và các nguyên tố vi lượng H3BO3, MnCl2·4H2O, ZnSO4·7H2O, CuSO4, H2MoO4, Fe-EDTA.
Hóa chất dùng trong mơi trường nuôi cấy bèo (môi trường Hoagnland): KNO3; KH2PO4; K2HPO4; K2SO4; MgSO4.7H2O; CaCl2; FeSO4.7H2O; H3BO3; MnCl2.4H2O; ZnSO4.7H2O; (NH4)Mo7O24.4H2O; CuSO4.5H2O; CoCl2.6H2O.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và tách chiết các hợp chất sạch
Xử lý mẫu, tạo dịch chiết tổng và chiết phân đoạn được thực hiện theo các phương pháp đang áp dụng tại các nước tiên tiến trên thế giới nhằm đảm bảo thành phần hố học và hoạt tính sinh học của mẫu khơng bị biến đổi.
2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất sạch
- Sử dụng các phương pháp sắc kí: Sắc ký cột pha thường (silica gel thường), pha đảo (RP18, YMC ODS), dùng nhựa trao đổi ion (Dianion HP20) hoặc hấp phụ cỡ hạt (Sephadex LH20) với các hệ dung môi hữu cơ thông dụng như hexan, diclometan, axeton, etyl axetat, metanol, nước, sắc kí lỏng điều chế prep. HPLC, sắc kí bản mỏng với các chất hấp phụ thuận, pha đảo pha phù hợp của hãng Merck; hệ dung môi rửa giải tăng dần độ phân cực (n-hexan, etyl axetat, methanol, nước….) để tách các hợp chất từ cao phân đoạn đã lựa chọn.
- Xác định cấu trúc các chất tách chiết được bằng các phương pháp phổ hiện đại bao gồm phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) (để xác định sự có mặt của các nhóm chức bằng tần số dao động đặc trưng của các nhóm chức), tử ngoại (UV), phổ NMR một chiều và hai chiều (1H, 13C-NMR, DEPT, HMBC,) để xác định số lượng H và C, số nhóm H và C các bậc khác nhau và cách tương tác của các nhóm, phổ khối lượng HR- ESI- MS để xác định khối lượng và công thức phân tử của các chất tinh sạch
2.3.3. Phương pháp đánh giá sinh trưởng của VKL, tảo lục Chlorella vulgaris và thực vật phù du thực vật phù du
2.3.3.1. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm tế bào:
M. aeruginosa và Ch. vulgaris thuộc nhóm tảo đơn bào, nên mật độ tế bào có thể đếm trực tiếp ở buồng đếm Sedgewick- Rafter (20 mn × 50 nm × 1 nm). Số tế bào được đếm trong 1ml dưới kính hiển vi quang học Olympus-BX51, Japan. Số lượng
52
N0/mL= C × 1000 𝑚𝑚3
𝐿.𝐷.𝑊.𝑆
Trong đó:
C: số lượng tế bào đếm được L: Chiều dài của mỗi thước D: chiều sâu của thước W: Chiều rộng của thước S: số ô đếm
2.3.3.2. Xác định sinh trưởng thông qua đo mật độ quang [61]
M. aeruginosa, Ch. vulgaris được nuôi trong môi trường dinh dưỡng CB hoặc
Sorokin và Krauss. Mẫu ni cấy chủng M. aeruginosa có bổ sung hoạt chất tại các nồng độ tương ứng được thu ở các thời điểm khảo sát (T0, T3, T6, T10). Mẫu được đo mật độ quang ở bước sóng 680 nm, sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis (Shimadzu, Nhật Bản) với độ lặp 3 lần. Hiệu quả ức chế sinh trưởng IE (Inhibition efficiency) được tính theo cơng thức:
IE (%) = 𝐎𝐃 (𝐕𝐨)−𝐎𝐃(𝐕𝐭)
𝐎𝐃(𝐕𝐨) × 100
Trong đó:
- OD (Vo): giá trị đo mật độ quang của mẫu đối chứng không bổ sung hoạt chất (coi nồng độ các hoạt chất là 0 µg/mL)
- OD (Vt): giá trị đo mật độ quang của mẫu bổ sung hoạt chất với nồng độ tương ứng
2.3.3.3. Xác định hàm lượng chlorophyll a (Lorenzen, 1965)
Một thể tích nhất định (V= 30 hoặc 50 mL) các dịch nuôi cấy VKL M. aeruginosa, chủng tảo lục Ch. vulgaris được lọc qua giấy lọc GF/C với kích thước lỗ
1,2 µm (Whatman GF/C). Mẫu được chiết bằng 10 ml axeton (90%) trong 24 giờ trong bóng tối tại nhiệt độ 5 0C. Sau đó được quay ly tâm 5000 vịng/phút trong 20 phút tại 15 0C. Lấy 3mL dịch chiết sau khi li tâm đo quang tại bước sóng 665 và 750 nm trước và sau khi bổ sung axit HCl 0,1M. Hàm lượng chlorophyll a được tính theo cơng thức sau [1]:
53 Trước axit: 𝐴𝑛𝑎665 = (𝐴𝑏665𝑛𝑎 - 𝑏𝑐665) – (𝐴𝑏750𝑛𝑎 -𝑏𝑐750) Sau axit 𝐴665𝑎 = (𝐴𝑎𝑏665- 𝑏𝑐665) – (𝐴𝑏750𝑎 -𝑏𝑐750) Chl a (àg.L-1) = 26,7 ì (665 665 )ì ì Trong đó:
Ana – hấp thụ tại bước sóng khi khơng có axit Aa- hấp thụ tại bước sóng có axit
v- thể tích axton ngâm mẫu (10 mL) V- thể tích lọc mẫu (L)
l: khoảng cách quang học của cuvet (1cm)
2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào VKL và Chlorella vulgaris [61]
Dịch nuôi cấy chủng M. aeruginosa và chủng Ch. vulgaris trong ngày T0, T3, T6 và T10 khi xử lý bằng cao chiết thực vật được lấy đi chụp ảnh TEM để đánh giá tác động của hoạt chất lên tế bào. Đầu tiên dịch ni cấy được ly tâm (5000 vịng/phút) trong thời gian 10 phút để thu lấy sinh khối. Mẫu các tế bào đó được xử lý trong dung dịch 2,5% glutaraldehyte/cacodylate 0,1 M, pH= 7,2 - 7,4. Sau khi rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1M mẫu tế bào được cố định lại bằng dung dịch OsO4 1% trong cacodylate 0,1M. Các tế bào được xử lý và qua quá trình kết tinh trong expoxy rein; cắt lát siêu mỏng ở mức 50-100 nm và nhuộm bằng Uranyl Acetate; quan sát lát cắt bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 ở các độ phóng đại khác nhau để quan sát sự khác biệt vi cấu trúc giữa tế bào đối chứng (khơng có tác động của hoạt chất) và tế bào chịu sự tác động của hoạt chất tại các thời điểm khác nhau.
2.3.5. Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Daphnia magna [134]
Đánh giá độc cấp tính của cao chiết lên D. magna được thực hiện theo hướng dẫn của APHA 2012. Trong mỗi bình chứa môi trường nuôi D. magna bổ sung vào
10 con D. magna non (< 24h tuổi) và đếm các con D. magna còn sống hoặc đã chết dưới tác dụng của dịch chiết trong vòng 24 và 48 giờ.
54
2.3.6. Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Lemna minor
Các phương pháp bao gồm [22]: Phương pháp đếm số cánh bèo: số cánh bèo
được đếm hằng ngày tại một thời điểm nhất định. Thống kê tất cả các cánh bèo được nhìn thấy. Phương pháp quan sát hình thái cánh bèo: các cánh bèo L. minor được chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số lại để so sánh tác động của các cao chiết sau 5 ngày với mẫu đối chứng. Phương pháp xác định trọng lượng tươi: bèo được ni trong mơi trường dinh dưỡng có bổ sung cao chiết thực vật và thu mẫu tại các thời điểm khảo sát (T0 và T5). Các cánh bèo được thấm khô nước bằng giấy ăn trước khi cân. Sử dụng cân phân tích AND model GR, Nhật Bản. Phương pháp phân tích hàm
lượng sắc tố quang hợp chlorophyll a và b: theo phương pháp của Wintermans & DeMots (1965)
2.3.7. Phương pháp phân tích chất lượng mơi trường nước
Các thông số thủy lý bao gồm: Các thông số thủy lý bao gồm nhiệt độ nước,
độ pH, hàm lượng oxy hòa tan (DO), độ dẫn điện, độ muối, độ đục, hàm lượng chất rắn hịa tan (TDS). Các thơng số này được đo hằng ngày trực tiếp tại hiện trường bằng máy đo nhanh WQC – 22 A (TOA, Nhật Bản) [17]
Các thơng số thủy hóa: Các thơng số thủy hóa bao gồm hàm lượng N-NO2-, N-NO3-, N-NH4+, photpho tổng, PO4-3 và Silic hòa tan được xác định trên các mẫu nước sau 0, 3, 6 và 10 ngày đặt thí nghiệm và được xác định bằng phương pháp so màu với máy đo quang UV-Vis 2450, Shimadzu – Nhật Bản. [17]
- Xác định NO2- (mg/L): mẫu sau khi tác dụng với axit sulfanilic và naphthylamine ở môi trường pH = 2 –2,5 tạo thành hợp chất màu đỏ tím của axit azobenzol naphthylamine sulfonic. Phép so màu được thực hiện tại bước sóng λ = 540 nm
- Xác định NH4+ (mg/L): trong mơi trường kiềm với sự có mặt của citrate trinatri
và natri hypoclorit, ion amoni phản ứng với phenol tạo phức màu xanh, đồng thời sử dụng cyanua natri làm chất xúc tác của phản ứng. Phép so màu được thực hiện ở bước sóng λ = 630 nm.
55
- Xác định Phốt pho tổng: chuyển hóa tồn bộ lượng photpho trong mẫu về dạng photphat (PO43-) (mg/L): trong mơi trường axit (H2SO4) với sự có mặt của K2S2O8. Sau đó tiến hành xác định theo phương pháp xác định hàm lượng photphat dưới đây.
- Xác định PO43- (mg/L): Trong môi trường axit, các ion photphat PO43- phản ứng với amoni molybdat tạo thành phức chất photphomolybdic. Phức chất này phản ứng với axit ascorbic cho ra dung dịch màu xanh đặc trưng. Phức chất kali antimonyl tactrat được cho thêm vào để thúc đẩy phản ứng và hạn chế ảnh hưởng của một số chất hữu cơ trong quá trình phản ứng. Phép so màu được thực hiện tại bước sóng λ = 885 nm.
- Xác định Silic (mg/L): Các ion silicate SiO32- trong môi trường axit phản ứng với molybdate tạo thành axit silico-molybdic có màu xanh. Ảnh hưởng của photphat trong mẫu sẽ được loại bỏ khi cho thêm axit oxalic. Phép so màu được thực hiện ở bước sóng λ = 885 nm
2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
Các phần mềm như Excel 2013, OriginPro 8, GraphPad 6 và SPSS 23.0, được sử dụng để xử lý số liệu thực nghiệm và đánh giá độ tin cậy với ý nghĩa xác xuất thống kê p< 0,05. Tất cả các thực nghiệm được lặp lại 3, 4 hoặc 5 lần.
2.4. Mô tả thực nghiệm
2.4.1. Thực nghiệm xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập chất sạch
56
Hình 2.10. Chiết phân đoạn hexan từ cao tổng
Hình 2.11. Chiết phân đoạn ethyl- axetat từ cao tổng
Bước 1. Thu mẫu
Mẫu tươi Mần tưới Eupatorium fortunei (lá và thân) được thu hái tại Sóc Sơn, Hà Nội vào tháng 03.2016. Mẫu được xác định tên khoa học bằng phân tích hình thái, làm tiêu bản và lưu giữ tiêu bản tại Bộ mơn Hóa cơng nghệ mơi trường, Khoa hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
Bước 2. Xử lý mẫu, phơi khơ trong bóng râm, xay nhỏ
28,5 kg mẫu tươi lá, thân cây Mần tưới sau khi thu hái được sơ chế loại bỏ tạp bẩn và các lá già rồi phơi khơ trong bóng râm để tránh các hoạt chất bị phân huỷ bởi ánh sáng và nhiệt độ. Để khơ hồn tồn, mẫu được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 45- 50ºC tại phịng Thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Mẫu sau đó được xay nhỏ thành bột mịn nhằm tăng khả năng tiếp xúc với dung môi, nâng cao hiệu suất chiết hoạt chất. Thu được 3,56 kg bột khô mẫu Mần tưới.
Bước 3. Ngâm chiết mẫu thực vật trong các dung môi
Dung môi EtOH, MeOH và nước là các dung mơi được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực hố thực vật do có khả năng hồ tan nhiều lớp chất hố học khác nhau. Lần 1 tạo cao chiết tổng, lựa chọn dung môi ethanol EtOH 96%. Đổ dung mơi EtOH vào bình tam giác có chứa bột mẫu thực vật sao cho ngập hết lớp mẫu bột (tỉ lệ 1kg bột khô trong 4 lit dung mơi). Đặt bình tam giác vào bể siêu âm trong vịng 30 phút ở nhiệt độ 40 -50 ºC. Gạn hết lớp dung dịch có chứa hoạt chất sau khi được ngâm
57
chiết, sau đó bổ sung dung mơi vào bình và lặp lại quá trình ngâm chiết 2 -3 lần nữa.
Bước 4. Cất loại dung mơi
Dịch chiết EtOH thu được từ q trình ngâm chiết được gom lại, lọc bằng bộ lọc hút Buchner loại tạp khơng tan sau đó được cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không (tại nhiệt độ T khoảng 550C, áp suất 70 kPa) thu được cao chiết tổng EtOH của Mần tưới (0,326 kg) với hiệu suất chiết tương ứng là 9,17. Các bước 1, 2 và 3 tiến hành trong quy mơ phịng thí nghiệm, nhiệt độ ổn định 23- 25 0C. Lặp lại quy trình tương tự với hai dung mơi là metanol (MeOH) và dung môi nước (W) thu được cao chiết tổng methanol, cao chiết tổng nước của Mần tưới tương ứng.
Hình 2.12. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mơ phịng thí nghiệm
Lý do tác giả luận án đã sử dụng cao chiết tổng etanol Mần tưới để triển khai chiết phân đoạn và tách chiết các chất sạch sẽ được giải thích trong mục 3.2.
Bước 5. Chiết phân bố với n-hexan
Từ 5,2 kg mẫu Mần tưới khô thu được 476,5 gam cao chiết tổng etanol Mần tưới. Cao chiết tổng EtOH Mần tưới sau khi đã loại hết dung mơi EtOH được hồ lại
Ngâm chiết với dung môi EtOH, MeOH, W Mẫu thực vật
Dịch chiết thô Bột khô nguyên liệu
Xử lý mẫu, phơi khô trong bóng râm, xay nhỏ
Lọc, cất loại dung mơi dưới áp suất giảm
58
vào trong nước với tỷ lệ 1 lít nước/100 g cao chiết. Dịch hồ tan có dạng huyền phù được chuyển vào phễu chiết và chiết phân bố với n-hexan (tỷ lệ 1 lít hexan /2 lít dịch). Do hexan là dung mơi kém phân cực nên nó hồ tan các thành phần rất kém tan trong nước. Lắc kỹ hỗn dịch sau đó để lắng cho nước và hexan tách lớp. Gạn lớp hexan ở trên sau đó lặp lại q trình chiết phân bố với hexan thêm 2 lần nữa. Gom dịch chiết hexan lại và cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không thu được 90,51 gam cao hexan với hiệu suất 18,97 %. Vì dung mơi n-hexan rất độc với sinh vật do đó nhóm nghiên cứu khơng tiến hành thử độc tính của cao chiết phân đoạn hexan lên sinh trưởng M. aeruginosa.
Bước 6. Chiết phân bố với etyl axetat (EtOAc)
Lớp nước còn lại sau khi chiết phân bố với hexan được chiết tiếp bằng dung mơi EtOAc. Q trình được tiến hành tương tự Bước 5, dịch chiết EtOAc gom lại được cất loại dung môi thu được cao EtOAc có khối lượng là 76,70 gam đạt hiệu suất 16,10%. Cao này được bảo quản ở nhiệt độ -5 ºC cho đến khi sử dụng. Thời gian bảo quản có thể từ 2-6 tháng.
Bước 7. Cất loại nước tạo cao nước
Dịch nước cịn lại sau khi chiết EtOAc được cơ đến khô bằng máy cất quay chân không (tại nhiệt độ khoảng 60 0C, áp suất dao động 80 kPa) thu được 280,82 gam cao chiết phân đoạn nước (hiệu suất là 60,27 %). Cao này được bảo quản ở nhiệt độ -5 ºC cho đến khi sử dụng.
Hình 2.13. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mơ phịng thí nghiệm
Cao n- hexan
- Hoà cao chiết với nước, - Chiết phân bố với hexane Cao chiết tổng EtOH
Cao EtOAc Cao H2O
Lớp nước ở dưới chiết phân bố với EtOAc
59
Kế thừa kết quả của những nghiên cứu trước, tác giả luận án đặt ra nhiệm vụ mới là tìm và lựa chọn dung mơi phù hợp để nâng cao hoạt tính diệt tảo của cao chiết tổng, tiến hành tạo cao chiết phân đoạn và tách chiết các hợp chất sạch.
Quy trình phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới