CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Mô tả thực nghiệm
2.4.1. Thực nghiệm xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập chất sạch
56
Hình 2.10. Chiết phân đoạn hexan từ cao tổng
Hình 2.11. Chiết phân đoạn ethyl- axetat từ cao tổng
Bước 1. Thu mẫu
Mẫu tươi Mần tưới Eupatorium fortunei (lá và thân) được thu hái tại Sóc Sơn, Hà Nội vào tháng 03.2016. Mẫu được xác định tên khoa học bằng phân tích hình thái, làm tiêu bản và lưu giữ tiêu bản tại Bộ mơn Hóa cơng nghệ mơi trường, Khoa hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
Bước 2. Xử lý mẫu, phơi khơ trong bóng râm, xay nhỏ
28,5 kg mẫu tươi lá, thân cây Mần tưới sau khi thu hái được sơ chế loại bỏ tạp bẩn và các lá già rồi phơi khơ trong bóng râm để tránh các hoạt chất bị phân huỷ bởi ánh sáng và nhiệt độ. Để khơ hồn tồn, mẫu được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 45- 50ºC tại phịng Thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Mẫu sau đó được xay nhỏ thành bột mịn nhằm tăng khả năng tiếp xúc với dung môi, nâng cao hiệu suất chiết hoạt chất. Thu được 3,56 kg bột khô mẫu Mần tưới.
Bước 3. Ngâm chiết mẫu thực vật trong các dung môi
Dung môi EtOH, MeOH và nước là các dung môi được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực hố thực vật do có khả năng hồ tan nhiều lớp chất hố học khác nhau. Lần 1 tạo cao chiết tổng, lựa chọn dung môi ethanol EtOH 96%. Đổ dung mơi EtOH vào bình tam giác có chứa bột mẫu thực vật sao cho ngập hết lớp mẫu bột (tỉ lệ 1kg bột khô trong 4 lit dung mơi). Đặt bình tam giác vào bể siêu âm trong vòng 30 phút ở nhiệt độ 40 -50 ºC. Gạn hết lớp dung dịch có chứa hoạt chất sau khi được ngâm
57
chiết, sau đó bổ sung dung mơi vào bình và lặp lại quá trình ngâm chiết 2 -3 lần nữa.
Bước 4. Cất loại dung môi
Dịch chiết EtOH thu được từ quá trình ngâm chiết được gom lại, lọc bằng bộ lọc hút Buchner loại tạp khơng tan sau đó được cất loại dung mơi bằng máy cất quay chân không (tại nhiệt độ T khoảng 550C, áp suất 70 kPa) thu được cao chiết tổng EtOH của Mần tưới (0,326 kg) với hiệu suất chiết tương ứng là 9,17. Các bước 1, 2 và 3 tiến hành trong quy mơ phịng thí nghiệm, nhiệt độ ổn định 23- 25 0C. Lặp lại quy trình tương tự với hai dung môi là metanol (MeOH) và dung môi nước (W) thu được cao chiết tổng methanol, cao chiết tổng nước của Mần tưới tương ứng.
Hình 2.12. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mơ phịng thí nghiệm
Lý do tác giả luận án đã sử dụng cao chiết tổng etanol Mần tưới để triển khai chiết phân đoạn và tách chiết các chất sạch sẽ được giải thích trong mục 3.2.
Bước 5. Chiết phân bố với n-hexan
Từ 5,2 kg mẫu Mần tưới khô thu được 476,5 gam cao chiết tổng etanol Mần tưới. Cao chiết tổng EtOH Mần tưới sau khi đã loại hết dung mơi EtOH được hồ lại
Ngâm chiết với dung môi EtOH, MeOH, W Mẫu thực vật
Dịch chiết thô Bột khô nguyên liệu
Xử lý mẫu, phơi khơ trong bóng râm, xay nhỏ
Lọc, cất loại dung môi dưới áp suất giảm
58
vào trong nước với tỷ lệ 1 lít nước/100 g cao chiết. Dịch hồ tan có dạng huyền phù được chuyển vào phễu chiết và chiết phân bố với n-hexan (tỷ lệ 1 lít hexan /2 lít dịch). Do hexan là dung mơi kém phân cực nên nó hồ tan các thành phần rất kém tan trong nước. Lắc kỹ hỗn dịch sau đó để lắng cho nước và hexan tách lớp. Gạn lớp hexan ở trên sau đó lặp lại quá trình chiết phân bố với hexan thêm 2 lần nữa. Gom dịch chiết hexan lại và cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không thu được 90,51 gam cao hexan với hiệu suất 18,97 %. Vì dung mơi n-hexan rất độc với sinh vật do đó nhóm nghiên cứu khơng tiến hành thử độc tính của cao chiết phân đoạn hexan lên sinh trưởng M. aeruginosa.
Bước 6. Chiết phân bố với etyl axetat (EtOAc)
Lớp nước còn lại sau khi chiết phân bố với hexan được chiết tiếp bằng dung mơi EtOAc. Q trình được tiến hành tương tự Bước 5, dịch chiết EtOAc gom lại được cất loại dung môi thu được cao EtOAc có khối lượng là 76,70 gam đạt hiệu suất 16,10%. Cao này được bảo quản ở nhiệt độ -5 ºC cho đến khi sử dụng. Thời gian bảo quản có thể từ 2-6 tháng.
Bước 7. Cất loại nước tạo cao nước
Dịch nước cịn lại sau khi chiết EtOAc được cơ đến khô bằng máy cất quay chân không (tại nhiệt độ khoảng 60 0C, áp suất dao động 80 kPa) thu được 280,82 gam cao chiết phân đoạn nước (hiệu suất là 60,27 %). Cao này được bảo quản ở nhiệt độ -5 ºC cho đến khi sử dụng.
Hình 2.13. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mơ phịng thí nghiệm
Cao n- hexan
- Hồ cao chiết với nước, - Chiết phân bố với hexane Cao chiết tổng EtOH
Cao EtOAc Cao H2O
Lớp nước ở dưới chiết phân bố với EtOAc
59
Kế thừa kết quả của những nghiên cứu trước, tác giả luận án đặt ra nhiệm vụ mới là tìm và lựa chọn dung mơi phù hợp để nâng cao hoạt tính diệt tảo của cao chiết tổng, tiến hành tạo cao chiết phân đoạn và tách chiết các hợp chất sạch.
Quy trình phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới
Từ 5,20 kg bột khô Mần tưới thu được 476,50 g cao chiết tổng etanol, tiếp tục chiết phân đoạn được 76,72g cặn chiết etyl axetat. Cao chiết phân đoạn etyl axetat tiến hành sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient (100% dicholorometan → 100% axeton v/v) thu được 7 phân đoạn EfD1.1 → EfD1.7. Tiến hành sắc ký phân đoạn EfD1.4 trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải dichlorometan/metanol (10/1 v/v) thu được hợp chất sạch EfD1.8 (100,0 mg) và 3 phân đoạn nhỏ EfD1.9, EfD1.10 và EfD1.11. Từ phân đoạn EfD1.9 tiến hành sắc ký trên cột silicagel cùng với hệ dung môi rửa giải ethyl axetat/metanol (50/1 v/v) thu được phân đoạn EfD5.3, tiến hành sắc ký EfD5.3 trên cột silica gel cùng với hệ dung môi rửa giải dichlorometan/metanol (15/1 v/v) thu được phân đoạn EfD7.3, phân đoạn EfD9.1 thu được khi sắc ký phân đoạn EfD7.3 trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải n-hexan/etyl axetat/metanol (5/50/1 v/v). Từ phân đoạn EfD9.1 tiếp tục sắc ký trên cột pha đảo RP18 cùng hệ dung môi metanol/nước (1/1 v/v) thu được hai phân đoạn EfD9.4 và EfD9.2, từ hai phân đoạn này tiếp tục sắc ký trên hai cột sắc ký và dung môi rửa giải phù hợp thu được hai hợp chất sạch tương ứng là
EfD10.1 (3,5 mg) và EfD10.3 (3,0 mg). Từ phân đoạn EfD1.10 tinh chế bằng cột
sắc ký silicagel thu được chất sạch EfD14.1 (16,0 mg). Phân đoạn EfD1.11 được tiến hành sắc ký trên các cột silica gel, cột pha đảo và hệ dung môi phù hợp thu được hợp chất sạch tương ứng EfD5.1 (55,0 mg), EfD4.8 (1,2 mg) và EfD4.7 (2,0 mg).
60
Hình 2.14. Quy trình tách chiết các hợp chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới
61
EfD4.7. Chất rắn màu trắng; []D24 = +0,2 (c 0.1, MeOH). HR-ESI-MS (positive):
m/z 221,0783 [M + Na]+ (tính tốn lý thuyết 221,0790 cho cơng thức C10H14NaO4).
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δH (m, J in Hz): 6,79 (1H, d, 2.0); 7,20 (1H, d, 7,5);
6,81 (1H, dd, 7,5; 2,0); 4,52 (2H, s); 3,76 (1H, d, 11.0); 13C NMR (125 MHz,
CD3OD): δC 140,1 (C-1); 116,3 (C-2); 156,8 (C-3); 133.5 (C-4); 129,5 (C-5); 120,5 (C-6); 64,9 (C-7); 76,9 (C-8); 72,4 (C-9); 26,1 (C-10).
EfD4.8. Chất rắn màu trắng. HR-ESI-MS (positive): m/z181.0864 [M + H]+ (tính tốn lý thuyết 181,0865 cho cơng thức C10H13O2). 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δH (m, J
in Hz) 6.82 (1H, d, 2.0); 7.12 (1H, d, 7.5); 6.80 (1H, dd, 7.5, 2.0); 4.55 (2H, s); 4.39 (2H, s); 5.41 (1H, d, 2.0) và 5.20 (1H, d, 2.0) và 13C NMR (125 MHz, CD3OD); δC 143.6 (C-1); 115.1 (C-2); 155.8 (C-3); 127.8 (C-4); 131.1 (C-5); 119.0 (C-6); 64.8 (C-7); 149.3 (C-8); 65.8 (C-9); 114.8 (C-10);
EfD5.1. Hợp chất EfD5.1 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng. 1H NMR (500
MHz, CD3OD): H 2,16 (3H, s, H-7); 3,74 (4H, s, H-9, 10); 6,57 (2H, br d, H-2, 6); 6,79 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5).
EfD1.8. Hợp chất EfD1.8 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. 1H NMR (500 MHz,
CD3OD): H 6,57 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-8), 6,83 (1H, br d, J = 1,0; 6,0; 8,5 Hz, H- 5), 6,86 (1H, d, J = 1,0; 7,5 Hz, H-3), 7,21 (1H, br d, J = 1,5; 6,0; 7,5 Hz, H-4), 7,49 (1H, br d, J = 1,5; 8,5 Hz, H-6), 7,99 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-7). 13C NMR (125 MHz,
CD3OD): C 122,6 (C-1), 158,1 (C-2), 118,6 (C-3), 132,5 (C-4), 120,7 (C-5), 129,9 (C-6), 142,4 (C-7), 116,9 (C-8), 171,3 (C-9).
EfD10.1. Hợp chất EfD10.1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. 1H NMR (500
MHz, CD3OD): H 2,74 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-7a); 3,71 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-7b); 7,04 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, 6); 7,33 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, 5), 9,70 (1H, s, -CHO).
13C NMR (125 MHz, CD3OD): C 147,2 (C-1); 116,1 (C-2, 6), 130,8 (C-3, 5); 141,7
(C-4), 39,3 (C-7), 64,5 (C-8), 193,0 (-CHO).
EfD10.3. Hợp chất EfD10.3 thu được dưới dạng chất bột màu vàng. 1H NMR (500
MHz, CD3OD): H 6,20 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6); 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8); 6,93 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3ʹ, 5ʹ); 8,12 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2ʹ, 6ʹ).
62
EfD14.1. Hợp chất EfD14.1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. 1H NMR (500
MHz, CD3OD): H 2,00 (3H, s, CH3CO-); 2,25 (3H, s, H-7), 3,85 (1H, d, J = 11,5
Hz, Ha-9); 3,90 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-9); 4,46 (1H, d, J = 11,5 Hz, Ha-10); 4,54
(1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-10); 6.61 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-2), 6,66 (1H, d, J = 1,0; 8,0 Hz, H-6); 7,19 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5).