II. Tổng quan về vi tảo lục H.pluvialis
5. Nuụi trồng H.pluvialis những cơ hội và thỏch thức
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.1. Phương phỏp phõn lập và lưu giữ vi tảo
* Phõn lập
Cỏc mẫu vi tảo được thu bằng lưới vợt thực vật phự du cú kớch thước mắt lưới phự hợp (từ 20 đến 40àm) ở cỏc ao hồ ở tỉnh Hoà Bỡnh trong năm 2009. Mẫu vi tảo sau khi thu được được cho vào lọ thuỷ tinh cú nỳt đậy đó được vụ trựng. Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 18-25P
0 P C, cường độ ỏnh sỏng từ 12-20 mol/mà P 2 P s và sau đú được giữ trong thựng lạnh (cú đỏ khụ hoặc đỏ thường) và vận chuyển về phũng thớ nghiệm để soi kớnh và phõn lập.
Phõn lập bằng micropipette: Đối với vi tảo lục H. pluvialis chỳng tụi sử dụng phương phỏp phõn lập bằng micropipette. Sử dụng micropipette để phõn lập từng tế bào riờng rẽ theo mục đớch nghiờn cứu (chủ yếu dựa vào cỏc đặc điểm hỡnh thỏi của từng loài). Cỏc tế bào được tỏch ra bằng kĩ thuật này được nuụi trong mụi trường lỏng, sau khoảng 3 4 tuần từ một tế bào cú thể phỏt triển thành vài chục đến vài –
trăm tế bào tuỳ từng loài, từ đú thu được cỏc dũng tế bào khỏc nhau. Ưu điểm của phương phỏp này là cú thể tỏch được những tế bào rất hiếm thấy trong tự nhiờn (chỉ xuất hiện ở mật độ thấp), cỏc loài khụng tạo khuẩn lạc trờn bề mặt thạch, cỏc loài tảo cú roi và cú khả năng di chuyển. Nhược điểm là thao tỏc và kĩ thuật hỳt tế bào khú, cần cú kinh nghiệm và kiến thức phõn loại hỡnh thỏi và yờu cầu phải cú một số dụng cụ chuyờn dựng cho kỹ thuật phõn lập này như pipette paster cú độ mỏng nhất định để bảo đảm cho việc thao tỏc tạo ra cỏc micropippette dễ dàng cho thao tỏc hỳt lấy một tế bào duy nhất từ mẫu cần phõn lập mà khụng bị lẫn cỏc tế bào khỏc khụng cần phõn lập.
Viện CNSH & Thực phẩm 35 Luận văn thạc sỹ khoa học - Cỏch tạo micropipette: cỏc micropippette được tạo ra bằng cỏch sử dụng cỏc
pipette pasteur được nung núng chảy vừa đủ trờn ngọn lửa đốn cồn. Sau đú dựng panh đó được kẹp sẵn ở đầu nhỏ của pippette paster để kộo nhỏ đầu pipette sao cho đường kớnh đầu pipette đạt khoảng 50 100 àm tuỳ theo kớch thước tế bào của loài -
tảo cần phõn lập được (hỡnh 12). Đường kớnh đầu micropipette càng gần đường kớnh của tế bào cần phõn lập càng tốt vỡ sẽ dễ cho việc hỳt tế bào. Sau đú dựng panh cắt đứt một đoạn ở phần đầu micropipette được tạo ra sao cho đầu được tạo ra phải là đầu bằng, bảo đảm cho một tế bào dễ dàng đi vào đầu micropippette theo dũng nước mao dẫn tại đầu micropipette hay dưới tỏc dụng của lực hỳt nhẹ do người thao tỏc tiến hành hỳt tế bào khi ngậm một đầu dõy silicon (loại dõy mềm, màu trắng trong) và đầu cũn lại của dõy silicon này được cắm vào đầu to của pippette paster
sau này.
Hỡnh 1 Thao t2. ỏc tạo micropipette từ cỏc pipette Pasteur
- Thao tỏc micropipette để phõn lập 1 tế bào duy nhất được chỉ ra trờn hỡnh 13.
Viện CNSH & Thực phẩm 36 Luận văn thạc sỹ khoa học
Cỏc bước tiến hành như sau:
+/ Sử dụng lam kớnh lừm cú 3 giếng 1, 2 và 3;
+/ Đưa mẫu tảo cần phõn lập vào giếng 1 trong khi giếng 2 và 3 chứa 1 giọt mụi trường nuụi C hoặc RM đó được khử trựng;
+/ Chuẩn bị ống hỳt lần lượt gồm: đầu cụn 1ml, ống hỳt bằng nhựa mềm,
micropipette;
+/ Soi kớnh ở độ phúng đại 100X, xỏc định đối tượng cần phõn lập; +/ Dịch chuyển micropipette đến vựng thị trường, tiếp sỏt với tế bào đớch; +/ Di chuyển và điểu khiển micropipette để hỳt 1 tế bào tảo từ giếng 1. Đầu micropipette giữ tế bào hỳt được sau đú chuyển sang giếng 2, tế bào được chảy ra khỏi pipette nhờ lực thổi nhẹ. Trong giếng 2 chứa tế bào tảo đớch cần phõn lập và cú thể cũn cú cỏc tế bào của loài tảo khỏc. Sau đú, tiến hành soi dưới kớnh hiển vi và lại dựng micropipette để hỳt tế bào cần phõn lập và chuyển sang giếng 3. Quỏ trỡnh này
được lặp lại cho đến khi gắp được tế bào đớch ra khỏi cỏc tế bào khỏc. Sau lần hỳt cuối cựng tế bào được đưa vào bỡnh phõn lập (như Eppendorf hoặc vào cỏc giếng của đĩa 96 giếng đó chứa mụi trường nuụi C hoặc RM thớch hợp).
+/ Mỗi lần hỳt khoảng 20 30 tế bào và mỗi một tế bào được chuyển vào một giếng -
trong phiến 96 giếng. Sau đú cỏc tế bào được nuụi dưới ỏnh sỏng yếu (để trỏnh hiện tượng quang ức chế xẩy ra).
Tất cả cỏc thao tỏc, dụng cụ sử dụng trong phương phỏp này đều phải vụ
trựng, nờn mọi thao tỏc đều được tiến hành trong box cấy vụ trựng. Cỏc tế bào tảo được sử dụng phõn lập bằng phương phỏp này cần phải được làm giàu sinh khối bằng mụi trường hoặc khụng (cỏc mẫu tảo tự nhiờn cú mật độ thấp). Khi tế bào sạch hoàn toàn, chuyển tế bào vào mụi trường mới (cú thể là mụi trường lỏng hoặc mụi trường thạch C hoặc RM cú chứa 1,2% agar). Cỏc tế bào được nuụi khoảng 3 4 tuần -
cần quan sỏt lại để thu được cỏc dũng tế bào tảo H. pluvialis thuần chủng.
* Lưu giữ giống
Sinh khối tảo H. pluvialis được duy trỡ và lưu giữ trờn mụi trường C, RM dạng lỏng và thạch nghiờng (cú chứa 1% agar) tại phũng Cụng nghệ Tảo, Viện
Viện CNSH & Thực phẩm 37 Luận văn thạc sỹ khoa học
Cụng nghệ sinh học. Lưu giữ tảo trờn mụi trường thạch nghiờng trong ống nghiệm được cấy chuyển 3 thỏng một lần. Khi cấy chuyển, dựng que cấy gạt vào khuẩn lạc và cấy sang ống thạch mới theo đường zic zac. Tần suất cấy chuyển trờn mụi trường lỏng thường ngắn hơn, khoảng 2 4 ngày/1 lần. -
Sau khi lưu giữ giống trong ống nghiệm thành cụng, tảo được cấy chuyển từ ống nghiệm sang cỏcbỡnh tam giỏccú thể tớch 250 ml cú chứa 150 ml mụi trường C với tần xuất cấy chuyển 3 ngày một lần, bổ sung mụi trường mới theo tỷ lệ nhỏ hơn
50%.