II. Tổng quan về vi tảo lục H.pluvialis
5. Nuụi trồng H.pluvialis những cơ hội và thỏch thức
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.2. Phương phỏp xỏc định sinh trưởng của tảo
2.2.2.1. Phương phỏp đo mật độ quang học (OD)
Mật độ tế bào cú thể được xỏc định một cỏch giỏn tiếp thụng qua phương phỏp đo mật độ quang học ở bước súng 680nm bằng mỏy quang phổ (ODR680R). Theo
phương phỏp này, số lượng photon ỏnh sỏng bị hấp thụ tỷ lệ thuận với lượng sinh khối tế bào trong mẫu đem đo (trừ những mẫu cú nồng độ tế bào quỏ cao), hay núi cỏch khỏc là trong những điều kiện nhất định thỡ OD tỷ lệ thuận với mật độ tế bào. Nếu giỏ trị OD > 1 thỡ cần pha loóng dung dịch sao cho OD luụn < 1.
2.2.2.2. Phương phỏp xỏc định mật độ tế bào bằng buồng đếm Burker - Turk
Dịch huyền phự của tảo được sử dụng để đếm mật độ tế bào (sử dụng buồng đếm Burker Turk, Đức). Mẫu được pha loóng trong trường hợp mật độ tế bào quỏ -
cao. Dựng pipett man hỳt khoảng 20àl mẫu cho vào buồng đếm, đậy lamen và đặt buồng đếm lờn kớnh hiển vi, trỏnh tạo bọt khớ, đếm tế bào ở vật kớnh 40x.
Mật độ tế bào được xỏc định theo cụng thức sau: Mật độ tế bào D =A*X*10P
4
Trong đú: D: mật độ tế bào (tế bào/mL); A: tổng số tế bào trong buồng đếm;
X: hệ số pha loóng.
Viện CNSH & Thực phẩm 38 Luận văn thạc sỹ khoa học
2.2.2.3. Xỏc độ sinh trưởng qua trọng lượng khụ
Trọng lượng khụ tảo (TLK, g/l) được xỏc định theo phương phỏp sấy khụ mẫu ở 80P0 P C như sau: Bước 1: Sấy cốc cõn ở 105P 0 P
C trong 3 giờ. Lấy cốc ra để nguội trong silicator (trong 30 phỳt). Cõn khối lượng cốc và lặp lại cho đến khối lượng cốc khụng đổi, được mR1 R(g).
Bước 2: Lấy10ml dịch tảo cho vào cốc đó sấy ở bước 1 và sấy ở 80P
0
P
C trong 24 giờ. Lấy ra để nguội trong silicator (30 phỳt), cõn khối lượng cốc và sinh khối. Lặp lại quỏ trỡnh sấy đến khối lượng khụng đổi được mR2 R(g). Tiến hành tương tự với 10ml mụi trường nuụi (khụng cú tảo) được mR3R(g).
Bước 3: Tớnh trọng lượng khụ của tảo theo cụng thức sau:
TLK (g/l) = 1000 10 ) m - (m - ) m - (m2 1 3 1 x
Trong đú: (mR2R – m1R R) là khối lượng khụ của (sinh khối tảo + mụi trường); (mR3R – m1R R) là khối lượng khụ của mụi trường.
2.2.2.4. Xỏc định cỏc thụng số tốc độ sinh trưởng đặc trưng (à) của tảo theo MĐTB MĐTB
Tốc độ sinh trưởng đặc trưng (à, /ngày):
à = (ln NRtR – ln N0RR) / (tt R R- t0R R)
Trong đú: NRtR , N0RR) là MĐTB ở thời điểm tt R Rvà t0R R(TB/ml); t là thời gian (ngày)
[Molina và cs., 2001).
2.2.2.5. Phương phỏp xỏc định hỡnh thỏi tế bào tảo H. pluvialis
Hỡnh thỏi tế bào được chụp bằng mỏy ảnh kỹ thuật số Canon IXY 7.0 của Nhật Bản ở điều kiện dưới kớnh hiển vi quang học Olympus CX21 ở độ phúng đại 400 lần và độ phúng đại của mỏy ảnh 3 lần.
Viện CNSH & Thực phẩm 39 Luận văn thạc sỹ khoa học
Kớch thước tế bào được đo bằng phần mềm MapInfo Professional 7.5: Sử dụng thước chuẩn để chụp ảnh chuẩn và tiến hành chụp ảnh tế bào cựng độ phúng đại với ảnh chuẩn sau đú chuyển ảnh vào mỏy tớnh và sử dụng cụng cụ đo khoảng cỏch trong phần mềm để xỏc định kớch thước tế bào, cụng thức xỏc định kớch thước tế bào như sau:
KT tb (ft): kớch thước tế bào đo được trờn ảnh bằng phần mềm;
KT tc (ft): kớch thước đo được trờn ảnh của đoạn thước chuẩn kớch thước thực tế là 25 àm.
2.2.2.6. Phương phỏp xỏc định hàm lượng chlorophyll a, b, carotenoit
(astaxanthin) ở vi tảo H. pluvialis
- Chuẩn bị : Aceton 90%, cỏt thuỷ tinh, chày, cối, khay đỏ, pipet 5, đầu cụn 5, giấy thấm, giấy GF/C, xylanh, nước cất, bỡnh định mức 10ml.
- Qui trỡnhtiến hành:
+/ Sinh khối tảo được nghiền với cỏt thuỷ tinh và bổ sung 10ml aceton. Sau đú lọc mẫu, định mức bằng aceton lờn 10ml (vỡ trong quỏ trỡnh làm bay hơi mất một phần aceton).
+/ Phần dịch trong được đo ở cỏc bước súng: 665, 645, 630 và 480 nm. +/ Hàm lượng cỏc sắc tố núi trờn được tớnh theo cụng thức sau
Mg sắc tố/mP 3
P(à/l) = C/V
Trong đú: V là lượng thể tớch dịch tảo đem lọc (lớt)
C (chlorophyll a) = 11,6 * E665 1,31 * E645 0,14 * E630- - C (chlorophyll b) = 20,7 * E645 4,34 * E665 4,42 * E630- - C (carotenoit tổng số) = 4,0 * E480
Với Ei: là giỏ trị OD đo được ở bước súng i.
(Đối với H. pluvialis, nhiều cụng trỡnh cụng bố cho thấy hàm lượng
carotenoit tổng số của tế bào chủ yếu là astaxanthin hấp thụ ở bước súng 480 nm. KT tb (ft) x 25 (àm)
Kớch thước tế bào (àm) =
Viện CNSH & Thực phẩm 40 Luận văn thạc sỹ khoa học
Do vậy, hàm lượng carotenoit ở tảo H. pluvialis được xem chớnh là hàm lượng của
astaxanthin) (Jeffrey và cs., 1997)
2.2.2.7. Phương phỏp xỏc định hàm lượng protein của tế bào vi tảo H. pluvialis
Định lượng protiein của tảo theo phương phỏp Lowry (Lowry và cs., 1951).
- Tỏch chiết protein
Lọc 10 ml dịch tảo bằng giấy lọc GF/C, cho vào lọ penicilin, cất trong ngăn đỏ tủ lạnh. Dựng panh gắp giấy lọc cú sinh khối tảo vào cối sứ đặt trong hộp đỏ, thờm cỏt thuỷ tinh, nghiền bằng chày cho đến khi sinh khối thấy mịn, thờm 1ml dung dịch NaCl 1M, nghiền tiếp, chuyển vào lọ penicilin.
Trỏng chày cối bằng 3ml dung dịch NaCl 1M, chia làm 3 lần đến khi dịch
trỏng khụng cũn màu xanh để thu sinh khối 1 cỏch tối đa.
Ủ trong lạnh 2giờ, ly tõm 12000 vũng/5 phỳt, thu lấy phần dịch trờn cho sang lọ penicilin khỏc.
Thờm 2V acetone, ủ lạnh qua đờm, ly tõm 12000 rpm/10 phỳt, thu tủa, làm khụ tủa trong 10 phỳt, hoà tan tủa trong 100 μl dung dịch NaCl 0,01M. Ly tõm 10000 rpm trong 20 phỳt, thu lấy phần dịch trong phớa trờn để tiến hành làm phản ứng Lowry
Viện CNSH & Thực phẩm 41 Luận văn thạc sỹ khoa học - Phản ứng Lowry
Dung dịch A: 2% NaR2RCO3 R Rhũa tan trong NaOH 0,1N
Dung dịch B: 0,5% CuSOR4Rtrong dung dịch 1% Natrikalitactrat
Dung dịch C: 49A: 1B Thuốc thử Folin Tiến hành:
Hỳt 300 àl dung dịch C cho vào ống mẫu;
Thờm 30 μl mẫu tỏch protein, lắc đều, để trong 10 phỳt;
Thờm 15 àl thuốc thử Folin, lắc đều, để trong 30 phỳt, thờm 1655 μl nước cất Đo OD ở bước súng 720 nm.
Viện CNSH & Thực phẩm 42 Luận văn thạc sỹ khoa học - Xõy dựng đường chuẩn: Tiến hành với 9 nồng độ protein chuẩn (albumin) từ 5–
100 àg, blank là mẫu 0 àg và kết quả đo được với protein chuẩn ở cỏc nồng độ khỏc nhau (bảng 4; hỡnh 14).
Bảng 4. Kết quả đo OD trong phương phỏp xõy dựng đường chuẩn protein STT Hàm luợng protein (àg) V dd C (àl) V Folin (àl) V HR2RO(àl) ODR720 0 300 15 1685 0,000 1 5 300 15 1680 0,006 2 10 300 15 1675 0,013 3 20 300 15 1665 0,026 4 30 300 15 1655 0,041 5 40 300 15 1645 0,045 6 50 300 15 1635 0,064 7 60 300 15 1625 0,088 8 80 300 15 1605 0,097 9 100 300 15 1585 0,111
Viện CNSH & Thực phẩm 43 Luận văn thạc sỹ khoa học y = 835.56x - 1.6958 r = 0.985 0 20 40 60 80 100 120 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 OD 720 H am lu on g Pr (à g)
Hỡnh 14. Đường chuẩn protein được xỏc lập giữa hàm lượng protein (àg) theo giỏ trị OD ở bước súng 720nm
- Từ kết quả thu được nờu trờn, chỳng tụi đó xõy dựng được đường chuẩn xỏc định
hàm lượng protein (àg) theo giỏ trị OD đo ở bước súng 720 nm với giỏ trị OD nằm trong khoảng [0; 0,110] theo phương trỡnh:
Y = 835,56 X – 1,6958
Trong đú, Y: hàm lượng protein (àg); X: giỏ trị ODR720R mẫu bằng dung dịch
ethanol 98% hoặc foocmon 4%.
- Cỏc số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và thống kờ ANOVA một thành
Viện CNSH & Thực phẩm 44 Luận văn thạc sỹ khoa học
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phõn lập và lưu giữ Haematococcus pluvialis trong phũng thớ nghiệm
Chỳng tụi đó tiến hành phõn lập H. pluvialisở cỏc mẫu nước thu được từ cỏc hồ nước ngọt ủa tỉnh Hũa Bỡnh trong năm 2009. Mẫu nước thu được khi mang về c
phũng thớ nghiệm được để lắng và một phần được ly tõm. Sau đú dịch cặn được đưa lờn lamen lừm để phõn lập bằng cỏch hỳt một tế bào. Khi phỏt hiện cú tế bào ở trong kớnh trường, dựng micropipette để hỳt lấy tế bào như đó mụ tả trong phần vật liệu và phương phỏp. Sau đú chuyển tế bào hỳt được sang phần lừm thứ 2 của lamen chứa mụi trường C (hoặc RM), lặp lại quỏ trỡnh nờu trờn khoảng 3 đến 4 lần (hỡnh 15) chỳng ta cú thể thu được tế bào sạch và cuối cựng chuyển tế bào hỳt được cho vào ống nghiệm (effpendoft). Tiến hành hỳt khoảng 30 40 tế bào cho vào 1 ống -
nghiệm. Sau đú, nuụi cỏc tế bào tảo dưới cường độ ỏnh sỏng 2 klux và nhiệt độ
25P 0
P
C (hỡnh 16).
Hỡnh 15. Hỳt một tế bào H. pluvialis bằng bằng micropipette
Hỡnh 16. Lưu giữ thành cụng vi tảo lục H. pluvialis trờn mụi trường thạch
Viện CNSH & Thực phẩm 45 Luận văn thạc sỹ khoa học
Với quy trỡnh trờn, chỳng tụi đó phõn lập thành cụng H. pluvialis và lưu giữ cũng như nhõn nuụi chỳng trờn quy mụ phũng thớ nghiệm, ở cỏc cấp độ khỏc nhau từ cỏc ống nghiệm, đến cỏc bỡnh tam giỏc 100, 250, 500 ml, 1 lớt và trờn quy mụ lớn hơn ở cỏc bỡnh nhựa 1,5 và 10 lớt trong điều kiện phũng thớ nghiệm cú sục khớ liờn tục (hỡnh 17). Trờn cơ sở đú chỳng tụi đó tiến hành nghiờn cứu sõu về một số điểm sinh lý, sinh húa của chỳng.
Hỡnh 17. Hỡnh ảnh chụp nuụi trồng tảo H. pluvialis trong mụi trường dinh dưỡng C hoặc RM ở cỏc bỡnh nhựa 1,5 lớt và 10 lớt
3.2. L a chự ọn điều kiện mụi trường nuụi cấy H. pluvialis trong cỏc thể tớch
bỡnh nuụi 1,5 và 10 lớt
Mụi trường nuụi cấy luụn cú vai trũ quan trọng, tỏc động lờn sinh trưởng và phỏt triển của H. pluvialis. Hiện nay trờn thế giới đó cú rất nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu tối ưu húa điều kiện nuụi cấy H. pluvialis được cụng bố. (Fabregas và cs., 2008), (Imamoglu và cs., 2007), (Kobayashi và cs., 1997). Tuy nhiờn, ở Việt Nam chưa cú một cụng trỡnh nghiờn cứu nào về điều kiện nuụi cấy tối ưu của loài vi tảo này. Vỡ vậy, việc nghiờn cứu tối ưu húa điều kiện mụi trường nuụi cấy loài vi tảo nờu trờn là rất cần thiết nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học cơ bản cho việc đảm bảo nuụi cấy thành cụng chỳng trờn cỏc quy mụ lớn khỏc nhau ở Việt Nam. Đặc biệt ở quy mụ phũng thớ nghiệm, chỳng tụi đó nghiờn cứu và nuụi cấy thành cụng được
H. pluvialis trong cỏc bỡnh nhựa 1,5 và 10 lớt, đõy là cơ sở khoa học giỳp cho việc cung cấp đủ sinh khối cho việc thử nghiệm nuụi trồng loài vi tảo lục này trờncỏc hệ thống bioreactor kớn khỏc nhau sau.
Viện CNSH & Thực phẩm 46 Luận văn thạc sỹ khoa học
Theo cụng bố của Imamoglu và cs., 2007 về mụi trường dinh dưỡng tối ưu cho sinh trưởng của lồi vi tảo này đó cho thấy (Imamoglu và cs., 2007), khi sử dụng cỏc mụi trường nuụi cấy khỏc nhau như BG11, BG11 cải tiến, OHM, C và RM, tảo H. pluvialis đều sinh trưởng tốt nhưng với tốc độ sinh trưởng khỏc nhau giữa cỏc mụi trường. Trong đú, tốc độ sinh trưởng của H. pluvialis lớn nhất đạt 9,50
x 10P 5
P
TB/ml ở mụi trường RM dưới điều kiện chiếu sỏng liờn tục 40 àmol photon mP - 2 P sP -1 P ở 25P 0 P
C sau 12 ngày nuụi cấy.
Kết quả nghiờn cứu lựa chọn về mụi trường dinh dưỡng ở cỏc cấp độ bỡnh
tam giỏc 250-500 và 1000ml (khụng được trỡnh bày ở đõy) ở điều kiện phũng thớ
nghiệm của chỳng tụi đó cho thấy trong 4 mụi trường nờu trờn, loài vi tảo
H.pluvialis được phõn lập tại tỉnh Hũa Bỡnh năm 2009 sinh trưởng tốt trờn 2 mụi trường C và RM. Do đú, trong đề tài này chỳng tụi cũng lựa chọn 2 mụi trường C và RM cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Lựa chọn mụi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của vi tảo lục H. pluvialis ở bỡnh 1,5 lớt
Kết quả lựa chọn điều kiện mụi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của H. pluvialis ở bỡnh nhựa 1,5 lớt được trỡnh bày ở hỡnh 18, 19, 20 và 21.
Hỡnh 18. Sự thay đổi mật độ tế bào và trọng lượng khụ của tảo H.pluvialis được nuụi trờn mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nhựa 1,5 lớt
Viện CNSH & Thực phẩm 47 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 19. Sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein ở tảo H. pluvialis được nuụi trong mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nhựa 1,5 lớt
Sự thay đổi cỏc thụng số mật độ tế bào, trọng lượng khụ, hàm lượng sắc tố và protein ở tảo H. pluvialis được nuụi trờn mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nuụi 1,5 lớt được chỉ ra trờn hỡnh 18, 19. Kết quả thu được trờn hỡnh 18 cho thấy sau 30 ngày nuụi cấy, mật độ tế bào (MĐTB) tảo đạt được 144,9 x 10P
4 P
TB/ml, TLK đạt đuợc 4,92 g/l. Cũn sau 52 ngày nuụi cấy cỏc giỏ trị này đạt được 375,10x10P
4 P
TB/ml,
18,138 g/l. Kết quả chỉ ra trờn hỡnh 19 cho thấy sau 30 ngày nuụi cấy, hàm lượng chlorophyll a đạt được là gần 2500 àg/l, astaxanthin 1800 àg/l, hàm lượng protein –
giảm dần trong suốt quỏ trỡnh nuụi cấy tảo từ 400,9 đến 24,99 pg/TB. Tương tự, sự thay đổi của cỏc thụng số tương ứng của tảo H. pluvialis trong mụi trường C được chỉ ra trờn hỡnh 20 và 21. Sau 30 ngày nuụi cấy, MĐTB đạt 91,75x10P
4 P
TB/ml, TLK – 4,79 g/l; chlorophyll a- gần 1500 àg/l, astaxanthin 1000 àg/l; hàm lượng protein –
giảm từ 219,4 đến 47,31 pg/TB. Như vậy, ở thể tớch bỡnh nuụi 1,5 lớt, tảo phỏt triển tốt trong mụi trường RM hơn so với C. Điều này cũng lại được khẳng định qua thụng số tốc độ sinh trưởng đặc trưng à. à đạt giỏ trị 0,234/ngày và 0,213/ngày tại thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại tương ứng với mụi trường RM và C. Ngoài ra, nếu so sỏnh về kinh phớ chi phớ cho mụi trường nuụi thỡ mụi trường RM cú giỏ rẻ chỉ bằng 1/3 so với mụi trường C. Do vậy, khi tiến hành nuụi cấy vi tảo H. pluvialis trờn cỏc thể tớch bỡnh nuụi lớn hơn nữa (>10 lớt), chỳng tụi đó quyết định chọn mụi trường thớch hợp cho nuụi cấy là RM nhằm giảm giỏ thành sản xuất sinh khối tảo giàu axtasanthin làm thức ăn cho cỏ hồi sau này.
Viện CNSH & Thực phẩm 48 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 20. Sự thay đổi mật độ tế bào, trọng lượng khụ của tảo H. pluvilis được nuụi trong mụi trường C ở thể tớch bỡnh nuụi 1,5 lớt.
Lựa chọn mụi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của vi tảo lục H. pluvialis ở bỡnh 10 lớt
Dựa trờn kết quả nghiờn cứu thu được về lựa chọn mụi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của tảo H. pluvialis ở thể tớch bỡnh nhựa 1,5 lớt được trỡnh bày ở phần nờu trờn, ở bỡnh nhựa 10 lớt chỳng tụi chọn mụi trường dựng cho nghiờn cứu là
RM.
Kết quả lựa ch n ọ về mụi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của loài vi tảo lục H. pluvialis ở bỡnh 10 lớt được trỡnh bày ở hỡnh 22 và 23.
Hỡnh 21. Sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein ở tảo H. pluvialis được nuụi trong mụi trường C ở thể tớch bỡnh nuụi 1,5lớt.
Viện CNSH & Thực phẩm 49 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 22. Sự thay đổi mật độ tế bào, trọng lượng khụ của tảo H. pluvialis được nuụi trong mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nuụi 10 lớt.
Hỡnh 23. Sự thay đổi hàm lượng sắc tố chlorophyll a, astaxanthin và protein ở tảo
H. pluvialis được nuụi trong mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nuụi 10 lớt.
Sinh trưởng của H. pluvialis trong bỡnh nuụi 10 lớt được đỏnh giỏ thụng qua