II. Tổng quan về vi tảo lục H.pluvialis
5. Nuụi trồng H.pluvialis những cơ hội và thỏch thức
3.3. Sự thay đổi hỡnh thỏi, kớch thước cũng như cỏc thành phần nội bào trong vũng
3.3.1. Nghiờn cứu vũng đời tự nhiờn của H.pluviali sở thể tớch bỡnh nuụ i1 lớt
Sinh trưởng của tảo H. pluvialisở cỏc cấp độ thể tớch bỡnh nuụi khỏc nhau là
khỏc nhau. Ngoài ra, cỏc chế độ dinh dưỡng cũng như khả năng khấy trộn và sục khớ cũng cú ảnh hưởng rất lớn tới sinh trưởng, phỏt triển cũng như khả năng tớch lũy astaxanthin của tảo.
Nghiờn cứu vũng đời của tế bào tảo ở cấp độ bỡnh tam giỏc 1 lớt trong phũng
thớ nghiệm đó được chỳng tụi thực hiện như sau: Tế bào tảo đang ở pha logarit (sinh dưỡng, màu xanh và cú 2 roi chuyển động) được nuụi trờn mụi trường C hoặc RM với mật độ tế bào khoảng 15-20x10P
4
PTB/mL đem ly tõm ở 6000 vũng/5 phỳt. Dịch ly tõm được loại bỏ phần trờn và thu cặn tế bào. Sau đú, cặn tế bào này được bổ sung vào mụi trường RM sao cho mật độ tảo trong bỡnh tam giỏc 1 lớt đạt 6x10P
4 P TB/mL. Thớ nghiệm được lặp lại với 3 bỡnh. Cỏc bỡnh thớ nghiệm được đặt ở điều kiện ỏnh sỏng huỳnh quang cú cường độ chiếu sỏng là 2 klux, nhiệt độ 25P
0 P
C, chu kỳ sỏng tối 12:12 giờ. Kết quả nghiờn cứu thu được được xử lý thống kờ bằng phần mềm excel.
Sự thay đổi MĐTB, hàm lượng sắc tố và protein của vi tảo H. pluvialis ở cỏc giai đoạn khỏc nhau được nuụi trồng trong bỡnh cú thể tớch 1 lớt được trỡnh bày ở
Viện CNSH & Thực phẩm 53 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 25. Sự thay đổi mật độ tế bào của H. pluvialis ở bỡnh tam giỏc 1 lớt trong mụi trường RM.
Hỡnh 26. Sự thay đổi của thành phần cỏc sắc tố và protein của H. pluvialis nuụi ở
bỡnh tam giỏc 1 lớt trong mụi trường RM
Kết quả thu được trờn hỡnh 25 đó cho thấy, thời gian khộp kớn vũng đời của tế bào H. pluvialis là khoảng 70 80 ngày được tớnh từ thời điểm cấy tảo vào mụi -
trường mới đến lỳc tế bào chớn hoàn toàn và lại được chuyển sang mụi trường mới để nảy mầm trở lại dạng sinh dưỡng như lỳc đầu. Hàm lượng sắc tố và protein cũng cú những biến đổi rất rừ rệt và phự hợp với từng giai đoạn của tế bào thể hiện trờn hỡnh 26. Hàm lượng chlorophyll a đạt cực đại sau 58 ngày với giỏ trị vào khoảng 550 àg/L và cú xu hướng giảm ở cỏc ngày tiếp theo. Hàm lượng astaxanthin tăng
Viện CNSH & Thực phẩm 54 Luận văn thạc sỹ khoa học
dần và đạt cực đại ở ngày thứ 64 với hàm lượng khoảng 700 àg/L. Hàm lượng protein giảm dần từ 680 pg/TB ở ngày thứ 6 xuống 210 pg/TB ở ngày thứ 64.
Sau 64 ngày tế bào chuyển sang dạng chớn hoàn toàn (tế bào cú màu đỏ rực) tiến hành chuyển toàn bộ tế bào sang mụi trường mới để tế bào nảy mầm trở lại. Lỳc này hàm lượng cỏc sắc tố và protein cũng thay đổi đỏng kể. Chlorophyll a tăng dần từ 120 àg/L lờn tới 650 àg/L sau 14 ngày nẩy mầm trở lại. Astaxanthin giảm từ giỏ trị 700 àg/L xuống 220 àg/L. Protein tăng từ giỏ trị 210 pg/TB lờn 430 pg/TB sau 6 ngày nẩy mầm trở lại và cú xu hướng giảm ở cỏc ngày tiếp theo (hỡnh 26).
Một số hỡnh ảnh miờu tả sự thay đổi hỡnh thỏi tế bào tảo H. pluvialis ở cỏc giai đoạn khỏc nhau trong vũng đời của tế bào tảo được chỉ ra ở hỡnh 27. Bảng tổng kết hỡnh thỏi, kớch thước và tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a ở cỏc giai đoạn trong vũng đời của H. pluvialis nuụi ở bỡnh tam giỏc 1 lớt được chỉ ra trờn bảng 5. Kết quả nghiờn cứu được chỉ ra trờn bảng 5 đó cho thấy cú thể sử dụng tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a để phõn biệt cỏc tế bào tảo đang ở cỏc giai đoạn khỏc nhau. Tỷ lệ nờu trờn cú giỏ trị 0,30 ± 0,05; 0,90 ± 0,20; 2,40 ± 0,10 và 0,60 ± 0,20 tương ứng với tế bào tảo ở cỏc giai đoạn sinh dưỡng, encyst, cyst và nảy mầm. Như vậy, khi tế bào ở giai đoạn sinh dưỡng và nẩy mầm thỡ tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a cú giỏ trị <1, cũn khi tế bào ở giai đoạn cyst thỡ tỷ lệ nờu trờn cú giỏ trị >1 với đặc trưng cho quỏ trỡnh tổng hợp astaxanthin được tăng cao.
Viện CNSH & Thực phẩm 55 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 27. Một số hỡnh ảnh miờu tả sự thay đổi hỡnh thỏi của tế bào ở cỏc giai
đoạn khỏc nhau trong vũng đời của H. pluvialis
Bảng 5. Bảng tổng kết hỡnh thỏi, kớch thước và tỷ lệ astaxanthin/ chlorophyll
a ở cỏc giai đoạn trong vũng đời của H. pluvialis nuụi ở bỡnh tam giỏc 1 lớt.
Giai đoạn Sinh dưỡng Encyst Cyst Nảy mầm
Trạng thỏi tế bào Tế bào hỡnh elip, màu xanh, cú hai roi. Kớch thước tế bào: 13 x 16 ữ 19 x 25 ± 0,50 àm Tế bào hỡnh cầu, màu xanh, khụng cú roi. Kớch thước tế bào: 14 ữ 30 ± 0,50 àm Tế bào hỡnh cầu, màu đỏ đậm, khụng cú roi. Kớch thước: 35 ữ 40 ± 0,20 àm Tế bào hỡnh elip, cú hai roi, màu nõu
đỏ đến xanh. Kớch thước: 8 x 11 ữ 10 x 15 ± 0,30 àm Tỷ lệ astaxanthin/ chlorophyll a 0,30 ± 0,05 0,90 ± 0,20 2,40 ± 0,10 0,60 ± 0,20
Viện CNSH & Thực phẩm 56 Luận văn thạc sỹ khoa học
3.3.2. Nghiờn cứu vũng đời tự nhiờn của tế bào tảo H. pluvialis ở thể tớch bỡnh
nuụi 1,5 lớt
Nghiờn cứu vũng đời của tế bào tảo H. pluvialis ở bỡnh 1,5 lớt được chỳng tụi tiến hành như sau: Tế bào đang ở giai đoạn pha logarit nuụi trờn mụi trường RM hoặc C được ly tõm 6000 vũng/ 5 phỳt loại dịch trờn và thu cặn tế bào. Tế bào được bổ sung vào cỏc bỡnh nhựa 1,5 lớt sao cho mật độ đạt 6x10P
4 P
TB/mL trong mụi
trường RM. Thớ nghiệm được bố trớ lặp lại 3 lần và cỏc bỡnh thớ nghiệm đều được bố trớ một đường sục khớ từ dưới đỏy lờn. Khớ sục vào được cấp bởi một mỏy sục và qua bộ lọc khụng khớ để đảm bảo khớ được sục vào bỡnh nuụi là sạch. Cứ 2 ngày/1 lần lấy mẫu thớ nghiệm để xỏc định mật độ tế bào, hàm lượng thành phần cỏc sắc tố và protein, đồng thời xỏc định hỡnh thỏi và kớch thước tế bào cũng được chụp và xỏc định kớch thước tế bào.
Sự thay đổi MĐTB, hàm lượng sắc tố và protein của vi tảo H. pluvialis ở cỏc giai đoạn khỏc nhau được nuụi trồng trong mụi trường RM trong bỡnh cú thể tớch 1,5 lớt được trỡnh bày ở hỡnh 28, 29.
Hỡnh 28. Sự thay đổi mật độ tế bào của H.pluvialis nuụi ở bỡnh nhựa 1,5 lớt trong mụi trường RM
Viện CNSH & Thực phẩm 57 Luận văn thạc sỹ khoa học
Kết quả chỉ ra trờn hỡnh 28 đó cho thấy sự thay đổi về MĐTB bào trong vũng đời của H. pluvialis ở bỡnh 1,5 lớt cú sục khớ. Sau 32 ngày thớ nghiệm, tế bào tảo chuyển hoàn toàn sang giai đoạn chớn, kớch thước tế bào tăng đỏng kể lờn tới 40-60 àm. Sự thay đổi về thành phần sắc tố và protein được thể hiện ở hỡnh 29, chlorophyll a đạt cực đại sau 26 ngày với hàm lượng là 1180 àg/L và giảm dần vào cỏc ngày tiếp theo. Astaxanthin đạt cực đại sau 34 ngày thớ nghiệm với hàm lượng 1400 àg/L, trong khi đú hàm lượng protein giảm xuống cũn 42 pg/TB sau 34 ngày thớ nghiệm. Giai đoạn nảy mầm được tớnh từ ngày tiếp theo sau khi tiến hành ly tõm dịch tảo đang ở giai đoạn chớn ở 6000 vũng/ 5 phỳt và bổ sung mụi trường RM hoàn toàn mới cho tảo. Lỳc này, khi gặp điều kiện thuận lợi về dinh dưỡng tế bào sẽ nảy mầm trở lại từ cỏc tế bào chớn theo 2 cỏch (dạng pamella hoặc nảy mầm trực tiếp) như đó trỡnh bày ở phần nờu trờn.
Cũng cần nhấn mạnh rằng quỏ trỡnh nảy mầm của tế bào tảo H. pluvialisxẩy ra theo 2 pha rừ rệt. Pha nhanh chỉ kộo dài trong vũng 24 giờ đầu khi tế bào được chuyển vào mụi trường đầy đủ dinh dưỡng và mới với những biến đổi rừ rệt, cũn pha chậm kộo dài trong một vài ngày sau đú.
Như vậy ở pha chậm của giai đoạn nảy mầm, sau khi chuyển vào mụi trương mới với đầy đủ dinh dưỡng, trong tế bào quỏ trỡnh tổng hợp chlorophyll a xẩy ra mạnh hơn. Khi đú, hàm lượng chlorophyll a tăng lờn tới giỏ trị 1200 àg/L sau 12
Hỡnh 29. Sự thay đổi hàm lượng sắc tố (chla, astaxanthin) và protein của
Viện CNSH & Thực phẩm 58 Luận văn thạc sỹ khoa học
ngày nẩy mầm trở lại nhưng hàm lượng astaxanthin lại giảm rừ rệt xuống cũn 180 àg/L sau 8 ngày nẩy mầm trở lại và tiếp tục tăng dần vào cỏc ngày tiếp theo. Hàm lượng protein tăng dần tới giỏ trị 150 pg/TB sau 12 ngày cho nẩy mầm (hỡnh 29). Cũn ở pha nhanh của giai đoạn nảy mầm, khi tế bào được chuyển vào mụi trường mới với đầy đủ dinh dưỡng thỡ chỉ cần sau 16 giờ được chuyển vào mụi trường mới đó bắt đầu xẩy ra sự phõn chia tế bào. Sau 18 giờ một số tế bào đó phõn chia hồn tồn ở dưới dạng cỏc bọc tế bào. Sau 20 giờ cỏc dạng bọc tế bào này bị vỡ ra và đồng thời từ cỏc bọc này đó giải phúng ra cỏc tế bào con. Khi đú, trong cỏc tế bào con, hàm lượng astaxanthin vẫn cũn khỏ cao và hàm lượng của nú tiếp tục giảm dần, đồng thời hàm lượng chlorophyll lại được tăng lờn.
Sau 9 ngày cho nẩy mầm trở lại, chỳng tụi nhận thấy số lượng tế bào ở dạng encyst giảm dần và hầu như khụng cũn. Điều này chứng tỏ tế bào tảo lại bắt đầu đi vào một chu kỳ mới và một vũng đời của tế bào lại tiếp tục được lặp lại. Sau 15 ngày tiếp theo chỳng ta cú thể thấy rất rừ sự thay đổi về hàm lượng sắc tố và protein đó xẩy ra. Tỷ lệ astaxanthin/ chlorophyll a tăng lờn giỏ trị 0,5, tức là tế bào lại bắt đầu đi vào giai đoạn nang bào.
Như vậy, chỳng ta cú thể cú thể nhận thấy ở bỡnh 1,5 lớt cú sục khớ, vũng đời của tế bào H. pluvialis bao gồm cỏc giai đoạn như sau: cần cú 30 ngày để tế bào sẽ chớn hoàn toàn và tiếp theo là giai đoạn nảy mầm tớnh từ lỳc chuyển toàn bộ tế bào chớn sang mụi trường mới và giai đoạn này kết thỳc sau 9 ngày.
Một số ảnh hỡnh thỏi tế bào tảo ở cỏc giai đoạn khỏc nhau trong vũng đời của
H. pluvialis đượcnuụi cấy ở bỡnh nhựa 1,5 lớt trong mụi trường RM được chỉ ra trờn
Viện CNSH & Thực phẩm 59 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 30. Một số ảnh hỡnh thỏi tế bào ở cỏc giai đoạn trong vũng đời của H. pluvialis nuụi ở bỡnh nhựa 1,5 lớt trong m
0 10 18N 32N 4h 16h 20h 2N 7N 13N
Viện CNSH & Thực phẩm 60 Luận văn thạc sỹ khoa học