II. Tổng quan về vi tảo lục H.pluvialis
5. Nuụi trồng H.pluvialis những cơ hội và thỏch thức
3.4. Nghiờn cứu sinh trưởng của vi tảo lục H.pluvialis trong điều kiện nuụi trồng
3.4.2. Nghiờn cứu sinh trưởng của H.pluvialis trong điều kiện sốc ỏnh sỏng (sau kh
tảo được chuyển vào điều kiện ỏnh sỏng cao)
-
H. pluvialis sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện ỏnh sỏng cú cường độ từ 2 5 klux (kết quả chi tiết về ảnh hưởng của cường độ ỏnh sỏng lờn sinh trưởng của tảo khụng được chỉ ra ở đõy). Ở điều kiện ỏnh sỏng cao hơn 2 5 klux, ỏnh sỏng cú tỏc dụng cảm ứng quỏ trỡnh tổng -
hợp astaxanthin ở loài vi tảo lục H. pluvialis được thể hiện qua thụng số hàm lượng astaxathin sẽ đạt giỏ trị cao hơn. Đặc biệt, dưới điều kiện ỏnh sỏng 7 10 klux, tảo này nhanh -
chúng được chuyển sang dạng cyst và tớch lũy nhiều astaxanthin trong tế bào, tế bào cú màu sắc đỏ rực.
Để nghiờn cứu khả năng tớch lũy astaxanthin cũng như những biến đổi hỡnh thỏi của tế bào dưới tỏc dụng của ỏnh sỏng cú cường độ cao, chỳng tụi đó tiến hành thớ nghiệm như sau: Sử dụng tảo đang sinh trưởng ở pha logarit trờn mụi trường C hoặc RM sẽ được ly tõm 6000 vũng/5 phỳt. Sau đú, loại bỏ dịch trờn và thu cặn tế bào. Tiếp theo, cặn tế bào được bổ sung vào bỡnh tam giỏc 500mL cú chứa 350 mL mụi trường RM sao cho mật độ tế bào đạt
6x10P 4
PTB/mL. Thớ nghiệm bao gồm 4 bỡnh tam giỏc được tiến hành nuụi cấy theo quy trỡnh 2 pha như sau. Pha 1: cỏc bỡnh thớ nghiệm được đặt ở điều kiện tối ưu về cường độ ỏnh sỏng (ỏnh sỏng huỳnh quang cú cường độ chiếu sỏng là 2 klux) để tế bào sinh trưởng phỏt triển bỡnh thường đạt sinh khối cao với chu kỳ chiếu sỏng tối là 12:12 giờ và kộo dài trong 15 ngày. Pha 2: sau 15 ngày thớ nghiệm ở pha 1, 4 bỡnh thớ nghiệm cú trạng thỏi sinh trưởng của tảo như nhau sẽ cú 2 bỡnh thớ nghiệm được giữ nguyờn ở điều kiện nuụi cấy tối ưu, cũn 2 bỡnh khỏc sẽ được đưa vào điều kiện nuụi cấy cú cường độ ỏnh sỏng từ 7 đến 10 klux. Chỳng tụi tiến hành theo d i sừ ự thay đổi về hỡnh thỏi tế bào, h m lượà ng protein và sắc tố
(chl a, b và astaxanthin) trong 24h đầu và cỏc ngày thớ nghiệm tiếp theo.
Sự thay đổi mật độ tế bào, hàm lượng protein, hàm lượng sắc tố chlorophyll a, astaxanthin của vi tảo lục H. pluvialis ở cỏc cụng thức thớ nghiệm trong điều kiện shock ỏnh sỏng được chỉ ra trờn hỡnh 41, 42, 43 và 44.
Viện CNSH & Thực phẩm 72 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 41. Sự thay đổi mật độ tế bào của H. pluvialis ở thớ nghiệm nuụi cấy 2 pha với pha 2 tảo được chiếu ỏnh sỏng cú cường độ 7-10klux.
Hỡnh 42. Sự thay đổi hàm lượng protein của H.pluvialis ở thớ nghiệm nuụi cấy 2 pha với pha 2 tảo được chiếu ỏnh sang cú cường độ 7-10 klux.
Viện CNSH & Thực phẩm 73 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 43. Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll a của H. pluvialis ở thớ nghiệm được nuụi cấy 2 pha với pha 2 tảo được chiếu ỏnh sang cú cường độ 7-10 klux.
Hỡnh 44. Sự thay đổi hàm lượng astaxanthin của H.pluvialis ở thớ nghiệm nuụi cấy 2 pha với pha 2 tảo được chiếu ỏnh sang cú cường độ 7-10 klux.
Viện CNSH & Thực phẩm 74 Luận văn thạc sỹ khoa học
Ở pha 1 là pha cú điều kiện nuụi trồng tối ưu cho sinh trưởng, tế bào phỏt triển bỡnh thường ở tất cả cỏc bỡnh thớ nghiệm và đạt mật độ tế bào gần 40x10P
4
PTB/mL. Ở pha này, tế bào chủ yếu ở dạng sinh dưỡng. Ở pha 2, sau 16 ngày, cỏc bỡnh thớ nghiệm được chuyển vào điều kiện nuụi cấy cú ỏnh sỏng cao là 7 và 10 klux. Ở pha 2, ở bỡnh thớ nghiệm nuụi tảo được chiếu ỏnh s ng cú cường độ 7 klux thỡ hầu như tảo khụng tăng về mật độ, cũn ở bỡnh ỏ
thớ nghiệm được chiếu ỏnh s ng cú cường độ 10 klux thỡ tảo bị ức chế sinh trưởng do hiện ỏ
tượng quang ức chế bởi ỏnh sỏng quỏ cao gõy ra. Trong điều kiện nờu trờn, mật độ tế bào giảm hẳn xuống giỏ trị 22x10P
4 P
TB/mL, trong khi đú, ở mẫu tảo ở cụng thức đối chứng, mật
độ tế bào tảo đạt tới giỏ trị 53x10P 4
P
TB/mL. Sự thay đổi rỏ rệt về hỡnh thỏi tế bào cũng cú thể
nhận thấy ngay sau 24 giờ tảo được chuyển vào điều kiện nuụi trồng được chiếu ỏnh sỏng cú cường độ cao.
Hàm lượng protein của tảo được nuụi ở cỏc bỡnh thớ nghiệm giảm nhanh chúng sau khi được chuyển vào nuụi cấy dưới điều kiện ỏnh s ng cú cường độ cao từ giỏ trị 500 pg/TB ỏ
xuống mức 100 pg/TB, đặc biệt ở cường độ ỏnh sỏng 10 klux – hàm lượng protein giảm xuống dưới giỏ trị 100 pg/ TB. Điều này chứng tỏ ở điều kiện chiếu ỏnh sỏng cao, tế bào tảo khụng những bị giảm sinh trưởng mà chỳng cũn chuyển sang cỏc giai đoạn khỏc rất nhanh
chúng.
Hàm lượng chlorophyll a ở tảo được nuụi trồng dưới điều kiện chiếu ỏnh sỏng cú cường độ cao cũng bị giảm một cỏch đỏng kể. Trong khi đú, tảo ở mẫu đối chứng lại cú hàm lượng chlorophyll a tăng lờn đến giỏ trị 1000 àg/mL cũn ở cỏc mẫu thớ nghiệm hàm lượng này giảm xuống dưới mức 200 àg/mL.
Hàm lượng astaxanthin ở cụng thức thớ nghiệm được chiếu ỏnh sỏng cú cường độ 7 klux đó đạt giỏ trị cao nhất, trờn 700 àg/mL sau 30 ngày và sau đú nhanh chúng đi vào trạng thỏi cõn bằng, tiếp đến là ở cụng thức tảo được chiếu ỏnh sỏng cú cường độ 10 klux là 500 àg/mL sau 24 ngày và hàm lượng này sẽ tiếp tục giảm ở cỏc ngày tiếp theo. Trong khi đú, tảo ở cụng thức đối chứng thỡ hàm lượng astaxanthin chỉ tăng sau ngày thứ 30 và đạt giỏ trị thấp đến 300 àg/mL.
Một số ảnh hỡnh thỏi tế bào ở cỏc giai đoạn trong quỏ trỡnh nuụi cấy 2 pha với pha 2 cú cường độ ỏnh sỏng cao được chỉ ra trờn hỡnh 45.
Như vậy, kết quả thớ nghiệm thu được của chỳng tụi đó cho thấy để tế bào tảo chuyển giai đoạn một cỏch nhanh chúng, chỳng ta cú thể sử dụng ỏnh sỏng cú cường độ cao, trong
Viện CNSH & Thực phẩm 75 Luận văn thạc sỹ khoa học
đú ỏnh sỏng cú cường độ tối ưu cho tăng cường tạo ra astaxanthin là 7 klux. Ở cường độ ỏnh sỏng cao hơn 7 klux sẽ gõy ức chế sinh trưởng của tảo và khả năng tạo astaxanthin cũng bị giảm sỳt. Sử dụng ỏnh sỏng cú cường độ cao là một trong những yếu tố mà chỳng ta cú thể dễ dàng chủ động thực hiện được để điều khiển sinh trưởng của vi tảo lục H. pluvialis đạt sinh khối cao nhất và sinh khối lại giàu astxanthin.
Hỡnh 45. Một số ảnh hỡnh thỏi tế bào ở cỏc giai đoạn trong quỏ trỡnh nuụi cấy 2 pha với pha
2 cú cường độ ỏnh sỏng cao
Pha 1: Tối ưu về điều kiện ỏnh sỏng cho sinh trưởng
Pha 2: Sốc ỏnh sỏng
0 15N
20N 7 klux 10 klux
24N 7 klux 10 klux
Viện CNSH & Thực phẩm 76 Luận văn thạc sỹ khoa học
Nghiờn cứu ảnh hưởng của tất cả cỏc yếu tố mụi trường khỏc nhau lờn sinh trưởng của tảo cũng như kớch thớch quỏ trỡnh sinh tổng hợp atxanthin ở vi tảo lục H. pluvialis sẽ cung cấp cho chỳng ta những phương ỏn lựa chọn thớch hợp, dễ thực hiện và rẻ tiền để cú thể nuụi trồng 2 pha loài vi tảo nờu trờn nhằm thu được sinh khối tảo giàu astaxanthin làm thức ăn cho cỏ hồi và cỏ cảnh trong thời gian tới là những nội dung nghiờn cứu cần phải sớm được thực hiện.
Viện CNSH & Thực phẩm 77 Luận văn thạc sỹ khoa học
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ cỏc kết quả nghiờn cứu đó được trỡnh bày ở phần nờu trờn, chỳng tụi xin rỳt ra một số kết luận như sau:
1/ Đó phõn lập thành cụng chủng Haematococcus pluvialis từ một số ao hồ của tỉnh Hũa Bỡnh, Việt Nam năm 2009 và lưu giữ thành cụng chỳng trờn mụi trường C và RM (thạch và lỏng).
2/ Trong 2 mụi trường được lựa chọn cho thớ nghiệm là RM và C với thể tớch bỡnh nuụi là 1,5 lớt thỡ mụi trường RM là tốt nhất. Trong mụi trường RM, sau 52 ngày nuụi cấy, tảo cú mật độ tế bào đạt đến 375,10x10P
4 P
TB/mL, trọng lượng khụ đạt giỏ
trị 18,138 g/l, hàm lượng chlorophyll a 2500 àg/l, astaxanthin 1800 àg/l, hàm –
lượng protein giảm dần trong suốt quỏ trỡnh nuụi cấy tảo từ giỏ trị 400,9 đến 24,99
pg/TB.
-Sau 35 ngày nuụi cấy, sinh trưởng của H. pluvialis trong bỡnh nuụi 10 lớt cú mật độ tế bào, trọng lượng khụ đạt giỏ trị cực đại là 41,5 x10P
4
Ptế bào/ml và 1,8 g/l, tương ứng. Hàm lượng chlorophyll a đạt giỏ trị gần 700 àg/l; hàm lượng astaxanthin gần -
210 àg/l cũn hàm lượng protein giảm dần từ giỏ trị 110,13 đến 32,52 pg/ tế bào.
3/ Vũng đời tự nhiờn của vi tảo lục H. pluvialis trong mụi trường C và RM ở cỏc bỡnh thớ nghiệm nuụi cú thể tớch 1; 1,5 và 10 lớt đều trải qua 4 giai đoạn với cỏc đặc điểm hỡnh thỏi, kớch thước và màu sắc tế bào thay đổi đặc trưng cho từng giai đoạn như sau:
+/ Giai đoạn sinh dưỡng: Tế bào sinh dưỡng cú hỡnh elip, màu xanh, cú hai roi chuyển động, kớch thước tế bào dao động từ 10 - 20àm. Giai đoạn này kộo dài khoảng 10 ngày nuụi cấy;
+/Giai đoạn tạo bào nang non (encyst):Kộo dài từ 10 đến 20 ngày nuụi cấy. Cỏc tế bào cú dạng hỡnh cầu, mất roi, khụng cú khả năng chuyển động. Kớch thước tế bào tăng lờn đỏng kể, khoảng 40 m. Ở giai đoạn này, tế bào cú sự biến đổi từ màu à
Viện CNSH & Thực phẩm 78 Luận văn thạc sỹ khoa học
+/ Giai đoạn tạo bào nang hoàn chỉnh (cyst): Sau 50 ngày nuụi cấy, cỏc tế bào
nang non chuyển thành nang hoàn chỉnh, tế bào cú màu sắc đỏ đậm. Đõy là giai đoạn trong tế bào tảo cú sự tớch lũy cao nhất astaxanthin;
+/ Giai đoạn nảy mầm: Kộo dài trong vũng 2 ngày. Cú 2 cỏch nảy mầm: 1/ từ một
tế bào nang hoàn chỉnh nảy mầm trực tiếp thành tế bào sinh dưỡng và 2/ nảy mầm giỏn tiếp thụng qua dạng pamella.
4/ Trong thớ nghiệm nuụi cấy 2 pha với pha 2 là pha đúi đạm (sử dụng mụi trường nuụi tảo thiếu nito), tế bào H. pluvialis ở giai đoạn sinh dưỡng đó chuyển rất nhanh
chúng sang giai đoạn bào nang (từ 5 10 ngày). Sau 10 ngày nuụi cấy tế bào tảo ở -
trong pha đúi đạm, hàm lượng chlorophyll a giảm từ giỏ trị 400 àg/L xuống cũn 180 àg/L, cũn hàm lượng astaxanthin tăng cao lờn tới giỏ trị 1100 àg/L.
5/ Với thớ nghiệm nuụi cấy 2 pha với pha 2 là pha tảo được nuụi trồng trong điều kiện chiếu ỏnh sỏng cú cường độ cao từ 7-10 klux, tế bào H. pluvialis đang ở giai đoạn sinh dưỡng cũng đó chuyển rất nhanh chúng sang giai đoạn bào nang (từ 5-10
ngày). Cường độ ỏnh sỏng tối ưu cho tớch lũy astaxanthin là 7klux, cũn ở cường độ chiếu sỏng cao hơn 7 klux sẽ gõy ức chế sinh trường của tảo cũng như lại làm giảm quỏ trỡnh tớch lũy astaxanthin. Sau 10 ngày nuụi cấy trong điều kiện chiếu sỏng với cường độ cao ở pha 2, hàm lượng chlorophyll a trong tế bào tảo giảm xuống dưới
200 àg/L cũn hàm lượng astaxanthin đạt giỏ trị trờn 700 àg/L.
KIẾN NGHỊ
Cỏc kết quả nghiờn cứu thu được của chỳng tụi trong đề tài này được trỡnh bày ở phần nờu trờn mới chỉ là cỏc kết quả bước đầu. Để cú thể đạt mục tiờu đề ra là nuụi trồng thành cụng vi tảo lục H. pluvialis đạt mật độ tế bào là 4 6 triệu tế bào/ -
mL, hàm lượng astxanthin chiếm 4 6% trọng lượng khụ của tảo thỡ cũn rất nhiều -
vấn đề khoa học cần phải tiếp tục nghiờn cứu như sau:
1/ Cần tiến hành nghiờn cứu ảnh hưởng của một số cỏc yếu tố mụi trường khỏc nhau lờn sinh trưởng phỏt triển cũng như sự hỡnh thành astaxanthin ở tảo H. pluvialis như nhiệt độ, ỏnh sỏng, pH, nguồn cacbon và nito khỏc nhau, nồng độ muối, tỷ lệ
Viện CNSH & Thực phẩm 79 Luận văn thạc sỹ khoa học
C/N…để cung cấp những số liệu khoa học làm cơ sở cho việc lựa chọn yếu tố giới hạn cho pha 2 trong quy trỡnh cụng nghệ nuụi cấy 2 pha ở loài vi tảo này;
2/ Cần tiếp tục nghiờn cứu quy trỡnh cụng nghệ nuụi cấy 2 pha loài H. pluvialis
trong cỏc hệ thống kớn 10; 20; 50 và 100 lớt và cỏc hệ thống bể hở hàng nghỡn lớt; 3/ Cần tiến hành nghiờn cứu quy trỡnh cụng nghệ thu sinh khối tảo H. pluvialis giàu astaxanthin bằng cỏc phương phỏp khỏc nhau như vật lý và húa học, sinh học… nhằm gúp phần làm giảm giỏ thành sinh khối tảo nuụi trồng được;
4/ Cần nghiờn cứu quỏ trỡnh bảo quản lõu dài sinh khối vi tảo nuụi trồng được đảm bảo chất lượng để sản xuất astaxanthin;
5/ Cần nghiờn cứu quy trỡnh tỏch chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo H. pluvialis
bằng cỏc dung mụi khỏc nhau và cỏc tỏc nhõn chớnh như nồng độ cỏc chất, nhiệt độ, thành phần cỏc loại dầu ảnh hưởng lờn hiệu xuất quỏ trỡnh tỏch chiết astaxanthin từ sinh khối tảo;
6/ Cần nghiờn cứu độc tớnh cấp, độc tớnh bỏn trường diễn của sinh khối tảo H. pluvialis và astaxanthin trờn động vật thực nghiệm để bảo đảm an toàn cho việc sử dụng chỳng làm thức ăn cho cỏ hồi sau này.
Viện CNSH & Thực phẩm 80 Luận văn thạc sỹ khoa học
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Tố Võn Cầm (2007) “Vi tảo trong nuụi trồng thuỷ sản”.Viện Nghiờn cứu Nuụi trồng thuỷ Sản II. Bỏo cỏo tại Nha Trang 29-31/5/2007.
2. Đinh Đức Hoàng, Lưu Thị Tõm, Nguy n Th Thu Thễ ị ủy, Đặng Di m ễ
Hồng (2011) “ Nghiờn cứu sự thay đổi h nh th i tỡ ỏ ế bào, hàm lượng sắc tố và protein n i b o trong vộ à ũng đờ ủi c a vi t o lả ục Haematococcus pluvialis nuụi
cấy trong điều kiện phũng thớ nghiờm”. Tạp ch SINH Hớ ỌC 33(1): 59-66. 3. Đặng Diễm Hồng, Đinh Đức Hoàng, Nguyễn Thị Thủy, Hoàng Thị Lan
Anh (2010) “ Lựa chọn mụi trường tối ưu để nuụi trồng vi tảo lục
Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin”. Tạp chớ SINH HỌC 32(2): 43- 53).
4. Đặng Diễm Hồng, Đặng Đỡnh Kim (1995) ”Ngiờn cứu một số đặc điểm sinh trưởng và quang hợp của hai loài tảo Dunaliella salina và Dunaliella bardawil”. Kỷ yếu của Viện Cụng nghệ Sinh học, Trung tõm KHTN & CNQG,
Nhà xuất bản KH và KT. Trang 280 -286).
5. Đặng Diễm Hồng, Lờ Thu Thuỷ, Choon - Hwan Lee (1998) “Tỏc động của cường độ ỏnh sỏng cao lờn hoạt động của chu tr nh xanthophyll và sự t ch luỹ ỡ ớ
β-carotene của vi tảo Dunaliella salina”. Tuyển tập bỏo cỏo khoa học, Hội nghị khoa học Cụng nghệ biển toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội 12-12/11/1998,
Tập II: 896-902
6. Đặng Đ nh Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền (1999)ỡ “Cụng nghệ sinh học vi tảo”. NXB Nụng nghiệp Hà Nội).
7. Vĩnh Khang (2007) “Kỹ thuật nuụi và chăm súc cỏc loại cỏ đẹp: cỏ cảnh, cỏ
La Hỏn”. NXB Thanh Niờn, 320 trang.
Tài liệu tiếng Anh
8. Acheampong, E and Martin, A. (1995) “Kinetic studies on the yeast Phaffia
Viện CNSH & Thực phẩm 81 Luận văn thạc sỹ khoa học Patel TR (1993) Production of astaxanthin by Phaffia rhodozyma using peat hydrolysates as substrate”. J Chem Technol Biotechnol 58:223–230.
9. Ako, H and Tamaru, C.S. (1999) Are feeds for food fish practical for
aquarium fish. Intl. Aqua Feeds 2, 30– 36.
10. Allen, R.G. and Tresini, M. (2000) Oxidative stress and gene regulation. Free Radic. Biol. Med. 28, 463–499.
11. Amcoff, P., Bửrjeson, H., Norrgren L and Pesonen, M. (1998) ,
“Cytochrome P4501A activity in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) - hepatocytes after exposure to PCB#126 and astaxanthin: In vitro and in vivo studies ”.Marine Environmental Research46: 1-5.