II. Tổng quan về vi tảo lục H.pluvialis
5. Nuụi trồng H.pluvialis những cơ hội và thỏch thức
3.1. Phõn lập và lưu giữ Haematococcus pluvialis trong phũng thớ nghiệm
Chỳng tụi đó tiến hành phõn lập H. pluvialisở cỏc mẫu nước thu được từ cỏc hồ nước ngọt ủa tỉnh Hũa Bỡnh trong năm 2009. Mẫu nước thu được khi mang về c
phũng thớ nghiệm được để lắng và một phần được ly tõm. Sau đú dịch cặn được đưa lờn lamen lừm để phõn lập bằng cỏch hỳt một tế bào. Khi phỏt hiện cú tế bào ở trong kớnh trường, dựng micropipette để hỳt lấy tế bào như đó mụ tả trong phần vật liệu và phương phỏp. Sau đú chuyển tế bào hỳt được sang phần lừm thứ 2 của lamen chứa mụi trường C (hoặc RM), lặp lại quỏ trỡnh nờu trờn khoảng 3 đến 4 lần (hỡnh 15) chỳng ta cú thể thu được tế bào sạch và cuối cựng chuyển tế bào hỳt được cho vào ống nghiệm (effpendoft). Tiến hành hỳt khoảng 30 40 tế bào cho vào 1 ống -
nghiệm. Sau đú, nuụi cỏc tế bào tảo dưới cường độ ỏnh sỏng 2 klux và nhiệt độ
25P 0
P
C (hỡnh 16).
Hỡnh 15. Hỳt một tế bào H. pluvialis bằng bằng micropipette
Hỡnh 16. Lưu giữ thành cụng vi tảo lục H. pluvialis trờn mụi trường thạch
Viện CNSH & Thực phẩm 45 Luận văn thạc sỹ khoa học
Với quy trỡnh trờn, chỳng tụi đó phõn lập thành cụng H. pluvialis và lưu giữ cũng như nhõn nuụi chỳng trờn quy mụ phũng thớ nghiệm, ở cỏc cấp độ khỏc nhau từ cỏc ống nghiệm, đến cỏc bỡnh tam giỏc 100, 250, 500 ml, 1 lớt và trờn quy mụ lớn hơn ở cỏc bỡnh nhựa 1,5 và 10 lớt trong điều kiện phũng thớ nghiệm cú sục khớ liờn tục (hỡnh 17). Trờn cơ sở đú chỳng tụi đó tiến hành nghiờn cứu sõu về một số điểm sinh lý, sinh húa của chỳng.
Hỡnh 17. Hỡnh ảnh chụp nuụi trồng tảo H. pluvialis trong mụi trường dinh dưỡng C hoặc RM ở cỏc bỡnh nhựa 1,5 lớt và 10 lớt
3.2. L a chự ọn điều kiện mụi trường nuụi cấy H. pluvialis trong cỏc thể tớch
bỡnh nuụi 1,5 và 10 lớt
Mụi trường nuụi cấy luụn cú vai trũ quan trọng, tỏc động lờn sinh trưởng và phỏt triển của H. pluvialis. Hiện nay trờn thế giới đó cú rất nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu tối ưu húa điều kiện nuụi cấy H. pluvialis được cụng bố. (Fabregas và cs., 2008), (Imamoglu và cs., 2007), (Kobayashi và cs., 1997). Tuy nhiờn, ở Việt Nam chưa cú một cụng trỡnh nghiờn cứu nào về điều kiện nuụi cấy tối ưu của loài vi tảo này. Vỡ vậy, việc nghiờn cứu tối ưu húa điều kiện mụi trường nuụi cấy loài vi tảo nờu trờn là rất cần thiết nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học cơ bản cho việc đảm bảo nuụi cấy thành cụng chỳng trờn cỏc quy mụ lớn khỏc nhau ở Việt Nam. Đặc biệt ở quy mụ phũng thớ nghiệm, chỳng tụi đó nghiờn cứu và nuụi cấy thành cụng được
H. pluvialis trong cỏc bỡnh nhựa 1,5 và 10 lớt, đõy là cơ sở khoa học giỳp cho việc cung cấp đủ sinh khối cho việc thử nghiệm nuụi trồng loài vi tảo lục này trờncỏc hệ thống bioreactor kớn khỏc nhau sau.
Viện CNSH & Thực phẩm 46 Luận văn thạc sỹ khoa học
Theo cụng bố của Imamoglu và cs., 2007 về mụi trường dinh dưỡng tối ưu cho sinh trưởng của lồi vi tảo này đó cho thấy (Imamoglu và cs., 2007), khi sử dụng cỏc mụi trường nuụi cấy khỏc nhau như BG11, BG11 cải tiến, OHM, C và RM, tảo H. pluvialis đều sinh trưởng tốt nhưng với tốc độ sinh trưởng khỏc nhau giữa cỏc mụi trường. Trong đú, tốc độ sinh trưởng của H. pluvialis lớn nhất đạt 9,50
x 10P 5
P
TB/ml ở mụi trường RM dưới điều kiện chiếu sỏng liờn tục 40 àmol photon mP - 2 P sP -1 P ở 25P 0 P
C sau 12 ngày nuụi cấy.
Kết quả nghiờn cứu lựa chọn về mụi trường dinh dưỡng ở cỏc cấp độ bỡnh
tam giỏc 250-500 và 1000ml (khụng được trỡnh bày ở đõy) ở điều kiện phũng thớ
nghiệm của chỳng tụi đó cho thấy trong 4 mụi trường nờu trờn, loài vi tảo
H.pluvialis được phõn lập tại tỉnh Hũa Bỡnh năm 2009 sinh trưởng tốt trờn 2 mụi trường C và RM. Do đú, trong đề tài này chỳng tụi cũng lựa chọn 2 mụi trường C và RM cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Lựa chọn mụi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của vi tảo lục H. pluvialis ở bỡnh 1,5 lớt
Kết quả lựa chọn điều kiện mụi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của H. pluvialis ở bỡnh nhựa 1,5 lớt được trỡnh bày ở hỡnh 18, 19, 20 và 21.
Hỡnh 18. Sự thay đổi mật độ tế bào và trọng lượng khụ của tảo H.pluvialis được nuụi trờn mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nhựa 1,5 lớt
Viện CNSH & Thực phẩm 47 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 19. Sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein ở tảo H. pluvialis được nuụi trong mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nhựa 1,5 lớt
Sự thay đổi cỏc thụng số mật độ tế bào, trọng lượng khụ, hàm lượng sắc tố và protein ở tảo H. pluvialis được nuụi trờn mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nuụi 1,5 lớt được chỉ ra trờn hỡnh 18, 19. Kết quả thu được trờn hỡnh 18 cho thấy sau 30 ngày nuụi cấy, mật độ tế bào (MĐTB) tảo đạt được 144,9 x 10P
4 P
TB/ml, TLK đạt đuợc 4,92 g/l. Cũn sau 52 ngày nuụi cấy cỏc giỏ trị này đạt được 375,10x10P
4 P
TB/ml,
18,138 g/l. Kết quả chỉ ra trờn hỡnh 19 cho thấy sau 30 ngày nuụi cấy, hàm lượng chlorophyll a đạt được là gần 2500 àg/l, astaxanthin 1800 àg/l, hàm lượng protein –
giảm dần trong suốt quỏ trỡnh nuụi cấy tảo từ 400,9 đến 24,99 pg/TB. Tương tự, sự thay đổi của cỏc thụng số tương ứng của tảo H. pluvialis trong mụi trường C được chỉ ra trờn hỡnh 20 và 21. Sau 30 ngày nuụi cấy, MĐTB đạt 91,75x10P
4 P
TB/ml, TLK – 4,79 g/l; chlorophyll a- gần 1500 àg/l, astaxanthin 1000 àg/l; hàm lượng protein –
giảm từ 219,4 đến 47,31 pg/TB. Như vậy, ở thể tớch bỡnh nuụi 1,5 lớt, tảo phỏt triển tốt trong mụi trường RM hơn so với C. Điều này cũng lại được khẳng định qua thụng số tốc độ sinh trưởng đặc trưng à. à đạt giỏ trị 0,234/ngày và 0,213/ngày tại thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại tương ứng với mụi trường RM và C. Ngoài ra, nếu so sỏnh về kinh phớ chi phớ cho mụi trường nuụi thỡ mụi trường RM cú giỏ rẻ chỉ bằng 1/3 so với mụi trường C. Do vậy, khi tiến hành nuụi cấy vi tảo H. pluvialis trờn cỏc thể tớch bỡnh nuụi lớn hơn nữa (>10 lớt), chỳng tụi đó quyết định chọn mụi trường thớch hợp cho nuụi cấy là RM nhằm giảm giỏ thành sản xuất sinh khối tảo giàu axtasanthin làm thức ăn cho cỏ hồi sau này.
Viện CNSH & Thực phẩm 48 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 20. Sự thay đổi mật độ tế bào, trọng lượng khụ của tảo H. pluvilis được nuụi trong mụi trường C ở thể tớch bỡnh nuụi 1,5 lớt.
Lựa chọn mụi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của vi tảo lục H. pluvialis ở bỡnh 10 lớt
Dựa trờn kết quả nghiờn cứu thu được về lựa chọn mụi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của tảo H. pluvialis ở thể tớch bỡnh nhựa 1,5 lớt được trỡnh bày ở phần nờu trờn, ở bỡnh nhựa 10 lớt chỳng tụi chọn mụi trường dựng cho nghiờn cứu là
RM.
Kết quả lựa ch n ọ về mụi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của loài vi tảo lục H. pluvialis ở bỡnh 10 lớt được trỡnh bày ở hỡnh 22 và 23.
Hỡnh 21. Sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein ở tảo H. pluvialis được nuụi trong mụi trường C ở thể tớch bỡnh nuụi 1,5lớt.
Viện CNSH & Thực phẩm 49 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 22. Sự thay đổi mật độ tế bào, trọng lượng khụ của tảo H. pluvialis được nuụi trong mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nuụi 10 lớt.
Hỡnh 23. Sự thay đổi hàm lượng sắc tố chlorophyll a, astaxanthin và protein ở tảo
H. pluvialis được nuụi trong mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nuụi 10 lớt.
Sinh trưởng của H. pluvialis trong bỡnh nuụi 10 lớt được đỏnh giỏ thụng qua mật độ tế bào (hỡnh 22). MĐTB tảo và trọng lượng khụ đạt cao nhất sau 35 ngày nuụi cấy với giỏ trị cực đại là 41,5 x10P
4
Ptế bào/ml và 1,8 g/l, tương ứng.
Sự thay đổi thành phần sắc tố và protein được chỉ ra ở hỡnh 23. Hàm lượng
chlorophyll a - gần 700 àg/l; hàm lượng astaxanthin gần 210 àg/l và hàm lượng -
protein giảm dần từ giỏ trị 110,13 đến 32,52 pg/ tế bào. Sự thay đổi cỏc thành phần sắc tố và protein trong nội bào của H. pluvialis rất đặc trưng cho cỏc giai đoạn trong vũng đời phỏt triển của nú. Khi tế bào ở trạng thỏi sinh dưỡng, với 2 roi chuyển
Viện CNSH & Thực phẩm 50 Luận văn thạc sỹ khoa học
động, trong nội bào chủ yếu là chlorophyll và protein và khi đú astaxanthin chưa được tớch lũy nhiều. Khi tế bào chuyển sang dạng nang bào, trong nội bào dần tớch lũy một lượng lớn astaxanthin, nhưng hàm lượng của chlorophyll và protein lại bị giảm xuống (hỡnh 23). Khi tế bào ở giai đoạn chớn, toàn bộ tế bào chuyển từ màu xanh sang màu đỏ rực, tế bào hỡnh cầu và mất roi khụng chuyển động.
Như vậy, qua cỏc kết quả nghiờn cứu đó thu được, chỳng tụi đó chọn được mụi trường tối ưu cho quy mụ lớn là mụi trường RM. Sinh trưởng sinh dưỡng của tảo kộo dài từ 15 20 ngày, giai đoạn chớn tớch lũy nhiều astaxanthin được xẩy ra chủ -
yếu sau 35 ngày.
3.3. Sự thay đổi hỡnh thỏi, kớch thước cũng như cỏc thành phần nội bào trong
vũng đời tự nhiờn của vi tảo lục H. pluvialis ở cỏc thể tớch bỡnh nuụi 1, 1,5 và 10
lớt
H. pluvialislà loài vi tảo lục cú vũng đời khỏ phức tạp, hỡnh thỏi, kớch thước tế bào cũng như cỏc thành phần nội bào như chlorophyll, astaxanthin và protein cú sự thay đổi rất khỏc nhau ở từng giai đoạn khỏc nhau trong vũng đời của tế bào tảo. Khi ở điều kiện thuận lợi, tế bào ở dạng sinh dưỡng màu xanh với hai roi chuyển động, ở giai đoạn này trong tế bào chủ yếu là cỏc chlorophyll, protein với hàm lượng cao. Khi mụi trường cạn kiệt dinh dưỡng, tế bào sẽ tớch lũy astanxanthin và chuyển sang dạng nang bào, kớch thước tế bào tăng lờn đỏng kể và tế bào cú màu đỏ rực.
Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cũng đó phỏt hiện và mụ tả được 4 giai đoạn trong vũng đời tự nhiờn của H. pluvialis (hỡnh 24).
Viện CNSH & Thực phẩm 51 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 24: Sự thay đổi hỡnh thỏi và kớch thước tế bào trong vũng đời của vi tảo H.
pluvialis được quan sỏt dưới kớnh hiển vi quang học với độ phúng đại 400 lần Như vậy, cú 4 dạng hỡnh thỏi tế bào của vi tảo H. pluvialis đó quan sỏt được trong vũng đời của chỳng (hỡnh 24). Cỏc tế bào sinh dưỡng hỡnh elớp, màu xanh, cú hai roi, cú khả năng chuyển động. Dạng tế bào này chiếm tới 90% so với tổng số tế bào trong 10 ngày nuụi trồng đầu tiờn; kớch thước tế bào dao động trong khoảng 13 x 16 ữ 19 x 25 àm. Từ 10 đến 20 ngày nuụi trồng tiếp theo, số lượng tế bào sinh dưỡng giảm dần, số lượng tế bào dạng encyst tăng dần đõy là tế bào hỡnh cầu, màu –
xanh, tế bào mất roi, khụng cú khả năng chuyển động. Sau 20 ngày nuụi trồng, cỏc
tế bào chuyển hoàn toàn sang dạng encyst và kớch thước tế bào tăng lờn rừ rệt (đạt khoảng 40 àm), nội chất trong tế bào chuyển sang màu nõu và bắt đầu tớch lũy astaxanthin. Sau 50 ngày nuụi, cỏc tế bào này hoàn toàn chuyển sang dạng cyst (nang bào tử hoàn chỉnh) cú màu đỏ đậm, thành tế bào dày, sắc tố chủ yếu là
astaxanthin.
Giai đoạn nảy mầm được tớnh từ khi chuyển cỏc tế bào dạng cyst vào trong mụi trường mới bằng cỏch ly tõm thu cặn tế bào. Giai đoạn này kộo dài trong vũng 2 ngày. Trong giai đoạn này cú 2 quỏ trỡnh biến đổi rất quan trọng. Trong 24 giờ
Viện CNSH & Thực phẩm 52 Luận văn thạc sỹ khoa học
đầu tiờn (ngay sau khi chuyển tế bào vào trong mụi trường mới) cú sự biến đổi màu sắc nội chất bờn trong tế bào từ đỏ đậm sang nõu đỏ, đồng thời xuất hiện sắc tố xanh. 24 giờ tiếp theo là giai đoạn nảy mầm thực sự. Cú 2 cỏch thức nảy mầm ở vi tảo H. pluvialis đó quan sỏt được: 1/ nảy mầm trực tiếp từ 1 nang bào tử hỡnh cầu, khụng di động thành 1 tế bào sinh dưỡng hỡnh elớp, cú 2 roi; và 2/ nảy mầm giỏn tiếp thụng qua pamella (cụm tế bào được bao bọc bằng một lớp màng). Khi đú, màng bao bọc pamella bị vỡ ra, từ một tế bào nang tạo ra 8 (hoặc nhiều hơn) tế bào sinh dưỡng. Tuy nhiờn, khi đú cỏc tế bào sinh dưỡng này vẫn chỉ chứa sắc tố màu đỏ trong nội chất tế bào. Chỉ sau 15 ngày nuụi cấy trong mụi trường mới, cỏc tế bào mới cú màu xanh hoàn toàn, tức là tế bào tảo trở về trạng thỏi sinh dưỡng.
3.3.1. Nghiờn cứu vũng đời tự nhiờn của H. pluvialis ở thể tớch bỡnh nuụi 1 lớt
Sinh trưởng của tảo H. pluvialisở cỏc cấp độ thể tớch bỡnh nuụi khỏc nhau là
khỏc nhau. Ngoài ra, cỏc chế độ dinh dưỡng cũng như khả năng khấy trộn và sục khớ cũng cú ảnh hưởng rất lớn tới sinh trưởng, phỏt triển cũng như khả năng tớch lũy astaxanthin của tảo.
Nghiờn cứu vũng đời của tế bào tảo ở cấp độ bỡnh tam giỏc 1 lớt trong phũng
thớ nghiệm đó được chỳng tụi thực hiện như sau: Tế bào tảo đang ở pha logarit (sinh dưỡng, màu xanh và cú 2 roi chuyển động) được nuụi trờn mụi trường C hoặc RM với mật độ tế bào khoảng 15-20x10P
4
PTB/mL đem ly tõm ở 6000 vũng/5 phỳt. Dịch ly tõm được loại bỏ phần trờn và thu cặn tế bào. Sau đú, cặn tế bào này được bổ sung vào mụi trường RM sao cho mật độ tảo trong bỡnh tam giỏc 1 lớt đạt 6x10P
4 P TB/mL. Thớ nghiệm được lặp lại với 3 bỡnh. Cỏc bỡnh thớ nghiệm được đặt ở điều kiện ỏnh sỏng huỳnh quang cú cường độ chiếu sỏng là 2 klux, nhiệt độ 25P
0 P
C, chu kỳ sỏng tối 12:12 giờ. Kết quả nghiờn cứu thu được được xử lý thống kờ bằng phần mềm excel.
Sự thay đổi MĐTB, hàm lượng sắc tố và protein của vi tảo H. pluvialis ở cỏc giai đoạn khỏc nhau được nuụi trồng trong bỡnh cú thể tớch 1 lớt được trỡnh bày ở
Viện CNSH & Thực phẩm 53 Luận văn thạc sỹ khoa học
Hỡnh 25. Sự thay đổi mật độ tế bào của H. pluvialis ở bỡnh tam giỏc 1 lớt trong mụi trường RM.
Hỡnh 26. Sự thay đổi của thành phần cỏc sắc tố và protein của H. pluvialis nuụi ở
bỡnh tam giỏc 1 lớt trong mụi trường RM
Kết quả thu được trờn hỡnh 25 đó cho thấy, thời gian khộp kớn vũng đời của tế bào H. pluvialis là khoảng 70 80 ngày được tớnh từ thời điểm cấy tảo vào mụi -
trường mới đến lỳc tế bào chớn hoàn toàn và lại được chuyển sang mụi trường mới để nảy mầm trở lại dạng sinh dưỡng như lỳc đầu. Hàm lượng sắc tố và protein cũng cú những biến đổi rất rừ rệt và phự hợp với từng giai đoạn của tế bào thể hiện trờn hỡnh 26. Hàm lượng chlorophyll a đạt cực đại sau 58 ngày với giỏ trị vào khoảng 550 àg/L và cú xu hướng giảm ở cỏc ngày tiếp theo. Hàm lượng astaxanthin tăng
Viện CNSH & Thực phẩm 54 Luận văn thạc sỹ khoa học
dần và đạt cực đại ở ngày thứ 64 với hàm lượng khoảng 700 àg/L. Hàm lượng protein giảm dần từ 680 pg/TB ở ngày thứ 6 xuống 210 pg/TB ở ngày thứ 64.
Sau 64 ngày tế bào chuyển sang dạng chớn hoàn toàn (tế bào cú màu đỏ rực) tiến hành chuyển toàn bộ tế bào sang mụi trường mới để tế bào nảy mầm trở lại. Lỳc này hàm lượng cỏc sắc tố và protein cũng thay đổi đỏng kể. Chlorophyll a tăng dần từ 120 àg/L lờn tới 650 àg/L sau 14 ngày nẩy mầm trở lại. Astaxanthin giảm từ