Chất IC50 (µg/ml) R2 (Ptx-Cur)-Co 0,41 > 0,95 (Ptx)-Co 0,75 > 0,95 Ptx 5,52 > 0,95 Ptx + Cur 6,3 > 0,95 Cur NA (không xác định)
Dựa vào bảng giá trị IC50 thu được chúng tơi khẳng định (Ptx-Cur)-Co có độc tính mạnh nhất trên dịng tế bào ung thư vú MCF-7 và lựa chọn (Ptx-Cur)-Co để thử nghiệm tiếp tục trên mơ hình khối cầu đa bào ung thư MCF-7 với thuốc đối chứng dương là Paclitaxel thương phẩm (Ebewe Pharma, Australia).
3.3.2.Độc tính trên mơ hình khối cầu đa bào ung thư MCF-7
3.3.2.1.Ảnh hưởng của DMSO 0,1% lên khối cầu đa bào ung thư MCF-7
DMSO là một dung mơi phổ biến để hịa tan nhiều chất trong các thử nghiệm độc tính. Tuy nhiên DMSO cũng có những ảnh hưởng nhất định lên tế bào ni cấy. Chính vì vậy mà nồng độ DMSO dùng trong các thử nghiệm cũng cần được theo dõi chặt chẽ. Trong nghiên cứu này, ngoài các đối chứng sinh học, chúng tơi cịn cịn tiến hành sử dụng thêm một nhóm đối chứng dung môi DMSO 0.1% nhằm kiểm tra ảnh hưởng của dung môi này lên các khối cầu đa bào MCF-7.
Ảnh hưởng của DMSO lên hình thái của khối cầu
Các đối chứng sinh học được theo dõi cho thấy có hình thái tương đối trịn, viền rõ ràng và chắc chắn. Dựa trên các kết quả nghiên cứu động học tăng trưởng của khối cầu đa bào ung thư MCF-7, chúng tôi lựa chọn thời điểm khối cầu 5 ngày tuổi để thử nghiệm độc tính. Đây là giai đoạn mà khối cầu đa bào tăng trưởng mạnh mẽ nhất nên nếu các chế phẩm có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư trong giai đoạn này sẽ là các thuốc có tiềm năng điều trị ung thư tốt. Thời điểm mà chất được bổ sung vào môi trường nuôi cấy các khối cầu được quy định là ngày 0 của thử nghiệm, các ngày tiếp theo lần lượt sẽ là 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.
Tại thời điểm ngày 0 của thí nghiệm, các khối cầu cho thấy có phần viền sinh trưởng chiếm phần lớn thể tích của khối, lõi hoại tử cịn rất nhỏ và mờ nhạt, từ ngày 2 trở đi l i hoại tử trở nên r ràng hơn và tăng kích thước cùng với sự tăng kích thước của tồn khối theo thời gian. Đến ngày thứ 7, kích thước của khối spheroid gia tăng đáng kể, trong đó l i hoại tử chiếm phần lớn trên tồn khối và có mầu rất tối, tuy nhiên phần viền của khối thì vẫn rất chắc chắn và lớp sinh trưởng khơng thể hiện sự bất ổn nào (Hình 21).
Các theo dõi và so sánh về hình ảnh cho thấy các các spheroid nuôi cấy trong điều kiện môi trường chứa DMSO 0,1% gần như khơng có sự thay đổi đáng kể nào về hình thái so với các đối chứng sinh học (Hình 21). Các số liệu về thời điểm xuất hiện lõi hoại tử, tỉ lệ giữa phần hoại tử so với viền sinh trưởng, sự tăng kích thước khối theo thời gian hay cấu trúc ổn định của phần viền sinh trưởng đều cho thấy có sự tương đồng cao giữa các spheroid sinh trưởng trong mơi trường có DMSO 0,1% so với các spheroid đối chứng sinh học. Như vậy có thể cho thấy tỉ lệ DMSO 0,1% trong môi trường nuôi cấy không gây ảnh hưởng tiêu cực hay làm biến đổi hình thái của các khối spheroid MCF-7.
Hình 21. Sự biến đổi hình thái và kích thước của các khối spheroid ở thí nghiệm
control, DMSO 0,1% qua 7 ngày điều trị. Bar=300µm
Ảnh hưởng của DMSO lên sự tăng trưởng thể tích khối khối cầu
Để tiến hành kiểm tra định lượng ảnh hưởng của DMSO lên sự tăng trưởng kích thước của khối spheroid chúng tôi tiến hành đo đạc và tính tốn thể tích của các khối spheroid nuôi cấy trong hai loại môi trường này trong sự so sánh với các đối chứng sinh học.
Biểu đồ Hình 22 thể hiện sự gia tăng về thể tích (tính theo % tăng thể tích tại một thời điểm so với thời điểm đầu tiên) của các khối spheroid ở hai thí nghiệm control, DMSO theo các thời điểm từ ngày 0 đến ngày 7. Các đồ thị ứng với hai thí nghiệm có sự tương đồng cao với dạng đường thẳng đi lên, tại thời điểm ngày 7 giá trị của đồ thị nằm trong khoảng 213% cho tới 226%.
Hình 22. Sự tương đồng cao trong tốc độ tăng trưởng thể tích của các khối spheroid ở
các thí nghiệm DMSO 0,1% và đối chứng sinh học.
Tiến hành xử lý thống kê bằng t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances trong Data Analysis của Microsoft Excel 2010 chúng tơi nhận thấy khơng có sự khác biệt về giá trị thể tích trung bình của các khối spheroid ni cấy trong môi trường chứa 0,1% DMSO so với các khối spheroid sinh trưởng trong mơi trường bình thường (α=0,01).
3.2.2.2.Ảnh hưởng của chế phẩm paclitaxel lên khối cầu đa bào ung thư MCF-7
Paclitaxel là thuốc chữa ung thư được sử dụng phổ biến hiện nay trong điều trị nhiều loại ung thư bao gồm cả ung thư vú. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng paclitaxel như một đối chứng dương để kiểm tra tính khả dụng của mơ hình khối cầu đa bào ung thư trong sàng lọc thuốc.
Ảnh hưởng của paclitaxel lên hình thái của khối cầu
vào môi trường nuôi cấy. Sự biến đổi rõ rệt nhất là ở phần viền sinh trưởng, nếu ở các đối chứng sinh học phần viền rất chắc chắn và rõ nét thì ở các nồng độ này cấu trúc viền khá lỏng lẻo¸ các tế bào ở lớp ngồi cùng có xung hướng bị tách ra khiến viền khối khơng bằng phẳng (Hình 23).
Hình 23. Những biến đổi trong cấu trúc viền sinh trưởng của khối spheroid ở hai nồng
độ paclitaxel 2µg/ml và 0,4µg/ml ở ngày thứ 3. Bar=300µm
Theo thời gian, sự phá hủy cấu trúc viền sinh trưởng do tác dụng của thuốc ở hai nồng độ nêu trên càng thể hiện rõ ràng, từ ngày thứ 4 trở đi thì phần viền gần như khơng thể quan sát được, đồng thời với đó là sự hoại tử xảy ra mạnh cả ở lớp sinh trưởng, điều không thấy xảy ra ở các đối chứng (Hình 24).
Hình 24. Cấu trúc viền khơng bình thường và các vị trí hoại tử xảy ra trên lớp sinh
trưởng ở ngày thứ 7 của các khơi spheroid ở hai nồng độ 2µg/ml và 0,4µg/ml.
Ở các nồng độ thấp hơn thì ảnh hưởng của thuốc lên cấu trúc viền khối spheroid thể hiện chậm hơn, với nồng độ 0,08µg/ml hay 0,016µg/ml có thể quan sát thấy rõ sau 2 ngày, với 0,0032µg/ml sau 3 ngày. Nồng độ thấp nhất thì tác dụng của thuốc lên sự biến đổi hình thái khơng sâu sắc như các nồng độ khác.
Ảnh hưởng của Paclitaxel lên sự tăng trưởng thể tích của khối cầu
Quan sát đồ thị sinh trưởng của các khối spheroid tại các nồng độ paclitaxel thử nghiệm (Hình 25) có thể thấy tác dụng ức chế sinh trưởng của paclitaxel đối với các khối spheroid MCF-7 là rất r ràng. Đặc biệt là ở các nồng độ cao (2 và 0,4µg/ml), đồ thị sinh trưởng trong 4 ngày đầu có xu hướng giảm dần đều (giảm mạnh nhất ở ngày 1, sau đó giảm từ từ ở ngày 2 đến ngày 4) và ln ở mức dưới 100%, hay nói cách khác là có sự suy giảm kích thước so với thời điểm đầu tiên (trong khi thể tích của đối chứng liên tục tăng). Đối với các nồng độ còn lại (0,08; 0,016; 0,0032µg/ml ), sự ức chế thể hiện ở mức thấp hơn, chủ yếu là hạn chế sự tăng thể tích của các khối spheroid. Cụ thể là ở bốn ngày đầu tiên, sự tăng kích thước ở các khối spheroid xảy ra rất chậm chạp, thậm chí khơng có sự tăng kích thước ở một số khối, giá trị tăng cao nhất ở nồng độ 0,0032µg/ml vào giai đoạn từ ngày 3 tới ngày 4 đạt khoảng 125% trong khi giá trị của đối chứng là khoảng 160%.
Từ sau ngày thứ 4 trở đi thì tình trạng chung ở các nồng độ thử nghiệm là các khối spheroid đều có sự tăng kích thước đáng kể so với thời điểm theo d i trước đó. Trong đó, giá trị thể tích của các khối ở nồng độ 0,0032µg/ml là khá cao vào khoảng 190%, các nồng độ 0,08; 0,016µg/ml khoảng 150% vào ngày thứ 6. Ở các nồng độ cao là 2 và 0.4µg/ml thì giá trị này thấp hơn, đặc biệt là ở nồng độ 2µg/ml vào ngày 6 cũng chỉ khoảng 110%.
Hình 25. Biểu đồ tăng trưởng thể tích tính theo % so với thời điểm ban đầu của các
khối spheroid sinh trư ởng trong 5 nồng độ paclitaxel (µg/ml)
Sử dụng t-Test: Two-Sample Assuming Equal của Microsoft Excel 2010, chúng tôi nhận thấy sự suy giảm kích thước của các khối spheroid do tác dụng của paclitaxel ở các nồng độ 2; 0,4; 0,08; 0,016µg/ml so với đối chứng sinh học là có nghĩa với α = 0,01. Sự khác biệt giữa các khối spheroid do sự ức chế ở nồng độ thứ 5 là không đáng kể (α=0,01).
3.2.2.3.Ảnh hưởng của hệ thuốc (Ptx-Cur)-Co lên khối cầu đa bào ung thư MCF-7
Ảnh hưởng của (Ptx-Cur)-Co lên hình thái của khối cầu
Những biến đổi về hình thái khối cầu spheroid dưới tác dụng của hệ thuốc (Ptx- Cur)-Co trong thời gian đầu tương đối là giống với tác dụng của paclitaxel. Ngay ở ngày 1 sau thử thuốc, ở các nồng độ cao như 2µg/ml hay 0,4µg/ml thì cấu trúc viền sinh trưởng của các khối spheroid có dấu hiệu bị tổn thương, một số tế bào ở lớp này bắt đầu tách ra
khỏi khối (Hình 26). Với các nồng độ (Ptx-Cur)-Co thấp hơn thì hiện tượng này xảy ra chậm hơn, vào khoảng ngày thứ 2. Thời gian tác dụng thuốc càng lâu thì những tổn thương trên cũng ngày càng nghiêm trọng hơn và làm mất hẳn cấu trúc viền chắc chắn của khối spheroid (vẫn thấy ở đối chứng sinh học).
Hình 26. Những biến đổi ở viển sinh trưởng của các khối spheroid điều trị với (Ptx- Cur)-Co ở ngày 1 của thử nghiệm. Bar=300µm
Sự khác biệt đáng chú về mặt hình thái của khối spheroid gây ra bởi (Ptx-Cur)- Co là sự phát triển của lõi hoại tử. Trong một so sánh tác dụng giữa hai chế phẩm Ptx và (Ptx-Cur)-Co trên cùng một nồng độ 2µg/ml có thể thấy rõ sự hoại tử gây ra bởi hệ thuốc (Ptx-Cur)-Co mạnh hơn nhiều so với paclitaxel thương phẩm dạng thường. Tại ngày thứ 4, toàn bộ các khối ở thí nghiệm (Ptx-Cur)-Co 2 µg/ml gần như đã hoại tử hồn tồn thì ở thí nghiệm Ptx 2µg/ml vẫn có thể quan sát được lõi và phẩn vỏ sinh trưởng tách biệt rõ ràng. Từ ngày thứ 5 trở đi, tuy sự hoại tử vẫn xảy ra ở thí nghiệm với Ptx 2µg/ml nhưng kích thước khối lại có dấu hiệu gia tăng so với thời điểm trước, cịn với thí nghiệm (Ptx-
Cur)-Co 2µg/ml thì các khối spheroid bắt đầu có hiện tương bị vỡ ( thường là từng đám tế bào bên ngồi tách ra khỏi khối) và làm kích thước khối giảm nhanh (Hình 27).
Hình 27. Sự hoại tử mạnh của các khối spheroid dưới tác dụng của (Ptx-Cur)-Co 2µg/ml. Bar=300µm
Đối với các nồng độ thuốc còn lại (Ptx-Cur)-Co 0,08; 0,016; 0,0032µg/ml, q trình hoại tử xảy ra mới mức độ thấp hơn và thời gian diễn ra chậm hơn.
Ảnh hưởng của (Ptx-Cur)-Co lên sự tăng trưởng thể tích của khối cầu
Quan sát biểu đồ Hình 28 (thể hiện tỉ lệ % tăng kích thước của các khối spheroid so với thời điểm ban đầu sau khi được điều trị bằng (Ptx-Cur)-Co) đồng thời so sánh với biểu đồ Hình 25 có thể nhận thấy rõ hệ thuốc (Ptx-Cur)-Co đã ức chế sinh trưởng và gây suy giảm thể tích của các khối spheroid mạnh hơn nhiều so với Ptx đơn độc. Trong khoảng thời gian 3 ngày đầu của thí nghiệm thì sự ức chế sinh trưởng xảy ra tương tự như giai đoạn 4 ngày đầu đối với điều trị bằng Ptx đơn độc. Ở hai nồng độ cao như 2µg/ml và 0,4µg/ml, đồ thị sinh trưởng có xu hướng giảm chậm, đạt giá trị trong khoảng 80% -
90%. Ở ba nồng độ thấp hơn, giá trị sinh trưởng của các khối spheroid cũng chỉ đạt xung quanh mức 100%, tức là gần như khơng có sự gia tăng thể tích so với thời điểm đầu tiên.
Từ ngày thứ 3 của thí nghiệm trở đi, sự phân hóa giữa các nồng độ thể hiện rõ hơn. Đặc biệt là ở nồng độ 2µg/ml, giá trị thể tích giảm nhanh chóng, đặc biệt xuống chỉ cịn khoảng 66% ở ngày thứ 4(trong giá trị thể tích thấp nhất gây ra bởi Pacliaxel 2µg/ml đạt được ở ngày thứ 4 là 82%). Hơn nữa, từ ngày thứ 4 trở đi, ở thí nghiệm Ptx 2 µg/ml, các khối spheroid bắt đầu có sự tăng kích thước (110% vào ngày 7) thì ở (Ptx-Cur)-Co 2µg/ml, q trình giảm kích thước vẫn diễn ra liên tục (chỉ cịn 50% vào ngày thứ 7). Với các nồng độ (Ptx-Cur)-Co 0,4 và 0,08 µg/ml thì hiện tượng giảm kích thước tương tư cũng diễn ra nhưng không mạnh như nồng độ cao nhất. Với hai nồng độ thấp nhất là (Ptx-Cur)-Co 0,016 và 0,0032µg/ml thì có sự tăng nhẹ kích thước từ ngày thứ 3, nhưng khơng đáng kể (Hình 28).
Hình 28. Đồ thị tăng trưởng thể tích tính theo % so với thời điểm ban đầu của các
Tiến hành phân tích bằng t-Test: Tow-Sample Assuming Equal của Microsoft Excel 2010, chúng tôi nhận thấy sự ức chế tăng sinh và gây suy giảm kích thước của các khối spheroid dưới tác dụng của 5 nồng độ (Ptx-Cur)-Co sử dụng trong thí nghiệm so với các đối chứng sinh học là có nghĩa (α=0,01).
So sánh độc tính của Ptx và (Ptx-Cur)-Co trên mơ hình khối cầu đa bào ung thư MCF-7
Đồ thị Hình 29 cho thấy tác dụng ức chế rõ rệt của (Ptx-Cur)-Co và Ptx 2µg/ml so với đối chứng sinh học với giá trị thể tích của các khối được điều trị bằng (Ptx-Cur)-Co và Ptx 2µg/ml đều thấp hơn đối chứng sinh học (α=0,01). Quá trình ức chế sinh trưởng do tác dụng của Ptx và (Ptx-Cur)-Co 2µg/ml diễn ra trong 3 ngày đầu tiên tương đối giống nhau. Tuy nhiên từ ngày thứ 4 trở đi, trong khi đồ thị sinh trưởng của các spheroid ở thí nghiệm (Ptx-Cur)-Co đi xuống rất mạnh thì đồ thị sinh trưởng của Ptx lại có xu hướng tăng nhẹ khiến cho sự chênh lệch giá trị thể tích giữa các spheroid trong hai thí nghiệm ngày càng chênh lệch.
Hình 29. Tác dụng ức chế vượt trội của (Ptx-Cur)-Co so với Ptx khi so sánh ở hai
Kiểm tra thống kê bằng t-Test: Two-Sample Assuming Equal chúng tơi có thể khẳng định giá trị trung bình của các khối spheroid thuốc thí nghiệm (Ptx-Cur)-Co là thấp hơn so với Ptx (với α=0,01). Tiến hành so sánh từng cặp thí nghiệm (Ptx và (Ptx-Cur)- Co) ở cùng nồng độ paclitaxel, chúng tôi thu nhận được kết quả tương tự (α=0,01).
Xây dựng đường cong đáp ứng liều tại ngày thứ 5 của thử nghiệm (hình 30) và tiến hành xác định giá trị IC50 bằng cách sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 (theo hướng dẫn sử dụng bộ kit CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay của hãng Promega) kết hợp với kiểm tra trên phần mềm GraphPad Prism 5 chúng tôi thu được giá trị IC50 của Ptx là 374µg/ml và (Ptx-Cur)-Co là 9,4µg/ml.
Hình 30. Đường cong đáp ứng liều của khối cầu đa bào ung thư vú MCF-7 dưới tác động của Ptx và (PTX-Cur)-Co.
3.4.Sự xâm nhập của thuốc vào bên trong khối cầu đa bào ung thư MCF-7
Curcumin thông thường tan rất kém trong nước hay môi trường nuôi cấy tạo thành các dạng tinh thể lớn (Hình 31A) trong khi được kết hợp trong hệ thuốc ở kích thước nanomet, khả năng hòa tan của curcumin tốt hơn nhiều, đồng thời tinhs chất phát huỳnh quang tự nhiên cũng khơng bị mất đi (Hình 31B). Chính vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng curcumin như một cơng cụ đánh dấu cho sự có mặt của hệ thuốc nano (Ptx-Cur)-Co.
Hình 31. Khả năng phát huỳnh quang màu xanh lá cây c ủa curcumin khi được kích thích. (A) Curcumin dạng thường kết tủa trong môi trường nuôi cấy. (B) Curcumin trong
hệ thuốc ở kích thước nanomet phân tán đều trong mơi trường nuôi cấy