2 .ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2 .Gây tạo khối cầu đa bào ung thư
Trong quy trình này, chúng tơi tiến hành gây dựng khối cầu đa bào bằng phương pháp giọt treo dựa trên phương pháp của Leoni A.Kunz Schughart, Marina Kreutz và Ruthknuechel sử dụng trong cơng trình cơng bố trên tạp chí Experimental Phatology số tháng hai năm 1998 [25]. Quá trình tạo khối cầu đa bào bằng phương pháp giọt treo có thể tóm tắt như sau:
Chuẩn bị tế bào
Tế bào sau khi hoạt hóa sẽ được nuôi cấy ổn đinh trong 2-3 ngày để đạt mật độ tế bào thích hợp trước khi tiến hành các thử nghiệm.
Xử lý bề mặt đĩa nuôi cấy
Để tạo bề mặt chống tế bào bám dính, chúng tơi tiến hành phủ đáy giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng bằng dung dịch agarose 1,5% pha trong dung dich PBS vô trùng theo các bước sau:
Pha dung dịch agarose 1,5% trong PBS 1x trong hood nuôi cấy tế bào và bảo quản trong điều kiện vô khuẩn, nhiệt độ thấp (2-8oC) trước khi sử dụng.
Dung dịch agarose được khử trùng bằng phương pháp khử trùng hơi nước bão hòa ở áp suất cao (nhiệt độ trong quá trình khử trùng đạt 120 - 140oC) để đảm bảo vơ trùng hồn tồn.
Bước 2. Phủ bề mặt giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng bằng dung dịch agarose 1,5%
Làm tan agarose 1,5% ở trạng thái đơng bằng lị vi sóng.
Phủ kín các giếng của đĩa nuôi cấy 96 dung dịch agarose 1,5% để tạo một lớp agarose phủ kín trên bề mặt giếng nuôi cấy khoảng 2-3mm.
Bước 3. Khử trùng đĩa nuôi cấy
Đĩa nuôi cấy 96 giếng sau khi được phủ agarose sẽ được khử trùng trong 30-45 phút bằng tia UV.
Tạo giọt treo
Bước 1. Chuẩn bị huyền phù tế bào với mật 103; 2,5x103; 5x103; 104; 2x104 /18µl mơi trường DMEM 10% FBS, 1% penicillin/streptromycin.
Thu nhận tế bào: Tế bào nuôi cấy sẽ được tách khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy bằng dụng dịch trypsin 0,4% pha trong PBS 1x vơ trùng.
Hịa tan cặn tế bào bằng môi trường nuôi cấy DMEM 10% FBS, 1% penicillin/streptromycin. Xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu.
Bước 2. Tạo và bảo quản giọt treo
Nhỏ lên phần nắp của đĩa ni cấy 96 giếng 15-20µl dung dịch tế bào đã chuẩn bị ở bước 1.
Chuyển tồn bộ đĩa ni cấy 96 có các giọt treo trên nắp vào tủ nuôi cấy tế bào và duy trì ở 37oC, 5% CO2 trong 24 - 36h.
Hạ giọt treo và chăm sóc khối cầu đa bào
Sau 24-36h treo trên nắp đĩa, các khối tế bào đã tụ tập với nhau sẽ được chuyển xuống các giếng nuôi cấy đã phủ agarose 1,5% và đã bổ sung môi trường nuôi cấy DMEM 10% FBS, 1% penicillin/streptromycin.