Chất Các nồng độ paclitaxel thử nghiệm (µg/ml) 1 2 3 4 5 (Ptx-Cur)-Co 2 0,4 0,08 0,016 0,0032 DMSO 0.1% 0 0 0 0 0 Control 0 0 0 0 0 Quy trình thí nghiệm
Gây tạo khối spheroid MCF-7 với nồng độ 5x103 tế bào/giọt treo.
Tiến hành chăm sóc các khối spheroid đã tạo được tới khi các khối cầu được 5 ngày tuổi, lựa chọn 39 khối có kích thước tương đồng phục vụ cho thử nghiệm.
Bổ sung các chất thử nghiệm vào các giếng theo như phần bố trí thí nghiệm để đạt được nồng độ phù hợp.
Tiến hành theo dõi (ghi lại hình ảnh) các biến đổi trong động học tăng trưởng của các khối cầu thử ngiệm so với đối chứng bắt đầu từ thời điểm ngày 0 (0h sau khi bổ sung thuốc vào các giếng nuôi cấy khối cầu đa bào).
Dừng thí nghiệm sau 8 ngày theo dõi (ngày 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7), tiến hành xác định độc tính bằng phương pháp MTT, giá trị IC50 được tính dựa vào phần mềm Microsoft Exel 2010 (theo hướng dẫn sử dụng bộ kit CellTiter 96® Non- Radioactive Cell Proliferation Assay của hãng Promega) kết hợp với kiểm tra trên phần mềm GraphPad Prism 5.
2.2.5.Nghiên cứu khả năng xâm nhập của thuốc vào mơ hình khối cầu đa bào
Tiến hành quan sát sự phân bố của (Ptx-Cur)-Co trong khối cầu đa bào ung thư theo quy trình sau:
Các khối cầu đa bào ung thư được điều trị với Ptx, (Ptx-Cur)-Co và Paclitaxel Oregon với nồng độ paclitaxel 2µg/ml.
Sau 24h, các khối cầu sẽ được thu từ các giếng nuôi cấy và chuyển lên các lam kính lõm.
Rửa để loại bỏ môi trường nuôi cấy và thuốc thử nghiệm bằng dung dịch PBS 1x khoảng 2-3 lần.
Bổ sung vào các lam kính lõm dung dịch PBS 1x để bảo quản các khối cầu
Tiến hành quan sát các mẫu trên dưới kính hiển vi laser quét đồng tụ LSM 510 dưới bước sóng kích thích 488nm.
3.KẾT QUẢ
3.1.Hoạt hóa và nhân ni dịng tế bào ung thư vú MCF-7
Tế bào ung thư vú dòng MCF-7 được bảo quản trong điều kiện nitơ lỏng sau khi được hoạt hóa sẽ được ni cấy bằng mơi trường DMEM bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh, trong điều kiện 37o
C, 5% CO2, 95% khơng khí. Tế bào khi mới hoạt hóa có dạng trịn, trơi nổi trong mơi trường nuôi cấy, viền tế bào sáng rõ, một số tụ tập lại với nhau thành cụm nhỏ (Hình 10A).
Hình 10. Tế bào MCF-7.
(A) Tế bào khi mới hoạt hóa trơi nổi trong mơi trường, dạng tròn, viền sáng rõ, phân bố tương đối đều trong môi trường nuôi cấy, tỉ lệ tế bào sống cao. (B) Tế bào sau 4 ngày nuôi cấy bao phủ khoảng 80% bề mặt đĩa nuôi cấy. Các tế bào bám dính khỏe mạnh và đạt mật độ thích hợp cho các thí nghiệm. Bar=50µm
Với thời gian phân chia 29h, sau 3-4 ngày nuôi cấy ổn định, số lượng tế bào tăng lên đáng kể, bao phủ phần lớn diện tích bề mặt đĩa ni cấy. Các tế bào liên kết rất chặt chẽ tạo thành từng đám tế bào lớn bám trên bề mặt nuôi cấy chứ không tạo thành từng tế bào riêng rẽ (Hình 10B). Sự liên kết tế bào - tế bào rất mạnh là một đặc trưng của dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và đây cũng là một yếu tốt quan trọng giúp cho sự hình thành khối cầu đa bào từ dòng tế bào này thuận lợi hơn.
3.2.Gây tạo và nghiên cứu động học sinh trưởng của khối cầu đa bào ung thư MCF-7
3.2.1.Kết quả tạo khối cầu đa bào ung thư MCF-7
3.2.1.1.Kết quả xử lý bề mặt đĩa
Việc phủ agarose lên bề mặt đĩa nuôi cấy cho phép ngăn cản sự tiếp xúc của tế bào với bề mặt đĩa nuôi cấy và do đó tạo điều kiện cho các tế bào liên kết lại với nhau trong môi dung dịch khi trơi nổi. Quan sát Hình11, ta có thể thấy ở phần giếng của đĩa nuôi cấy 96 khơng có phủ agarose, các tế bào bám dính chặt trên nền đĩa nên chỉ tạo thành đơn lớp tế bào. Trong khi đó, với các nền giếng được phủ bằng agarose, các tế bào không bám được mà tụ tập lại với nhau thành các cụm tế bào trơi nổi trong mơi trường.
Hình 11. Sự bám dính của các tế bào MCF-7.
(A) Hình ảnh bám dính của các tế bào MCF-7 trên nền đĩa nuôi cấy thông thường. (B) Các tế bào MCF-7 khơng thể bám dính trên nền đĩa có phủ agarose nên tụ tập lại thành đám trôi nổi trong mơi trường.Bar=50µm
3.2.1.2.Kết quả tạo giọt treo
được kết quả như Hình 12. Có thể thấy ở hầu hết các giọt treo, các đám tế bào đã liên kết với nhau một cách chắc chắn và có thể hạ xuống các giếng ni cấy đã có phủ agarose và tiến hành ni cấy.
Hình 12. Sự liên kết của các tế bào MCF-7 trong giọt treo.
(A) Các tế bào phân bố đều trong giọt treo tại thời điểm 0h sau khi tạo giọt. (B) Các khối tế bào tụ tập trong giọt treo sau 24h. (C) Các đám tế bào tụ tập thành khối duy nhất sau 36h. Bar=50µm
Tỉ lệ hình thành các khối tế bào duy nhất bên trong các giọt treo sau 24-36h treo giọt dung dịch tế bào được thể hiện trong bảng 7.