5.1.Kết luận
Với các kết quả đã thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:
Gây tạo thành cơng khối cầu đa bào ung thư từ dịng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MCF-7 bằng phương pháp giọt treo với mật độ tế bào từ 5x102-2x104 tế bào/giọt treo, trong đó nồng độ 5x103 tế bào là thích hợp nhất cho các thử nghiệm.
Xác định thời gian sống của khối cầu đa bào ung thư MCF-7 khoảng 28 ngày, lõi hoại tử xuất hiện vào khoảng ngày thứ 5-6, sự tăng trưởng kích thước khối diễn ra mạnh nhất trong khoảng ngày 2-5.
Hệ thuốc (Ptx-Cur)-Co có độc tính mạnh nhất trong các hợp chất được thử nghiệm đối với khối cầu đa bào ung thư MCF-7 với giá trị IC50 là 9,4µg/ml, mạnh hơn 40 lần so với paclitaxel đơn độc.
Đã nghiên cứu được sự xâm nhập của hệ thuốc vào khối cầu đa bào ung thư theo thời gian dựa trên khả năng phát huỳnh quang tự nhiên của Curcumin.
5.2.Kiến nghị
Để hồn thiện và phát triển nghiên cứu này, chúng tơi đề xuất:
Tiến hành gây tạo mơ hình khối cầu đa bào ung thư trên các dòng tế bào ung thư khác.
Phát triển các mơ hình ni cấy ba chiều phức tạp hơn từ nền tảng mơ hình khối cầu đa bào ung thư MCF-7.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Barasoain I, Diaz JF, Andreu JM (2010), Chapter 19 - Fluorescent Taxoid Probes
for Microtubule Research, Academic Press,
2. Bjerkvig R (1992), "Spheroid culture in cancer research". Boca Raton Publisher, Vol. 1 (p. pp.135-158.
3. Bourrat-Floeck B, Groebe K, Mueller-Klieser W (1991), "Biological response of multicellular emt6 spheroids to exogenous lactate". International Journal of Cancer, 47 (5), p. 792-799.
4. Chakraborty, B.S. (2001), "7 - Cancer drug development - Key regulatory considerations". Health Administrator, 20 (p. pp. 29-36.
5. Charafe-Jauffret E, Ginestier C, Monville F, Finetti P, Adelaide J, Cervera N, Fekairi S, Xerri L, Jacquemier J, Birnbaum D, Bertucci F (2005), "Gene expression profiling of breast cell lines identifies potential new basal markers". Oncogene, 25 (15),
p. 2273-2284.
6. Chignell CF, Bilskj P, Reszka KJ, Motten AG, Sik RH, Dahl TA (1994), "Spectral And Photochemical Properties Of Curcumin". Photochemistry and Photobiology, 59 (3), p. 295-302.
7. Choi H, Chun Y-S, Kim S-W, Kim M-S, Park J-W (2006), "Curcumin Inhibits Hypoxia-Inducible Factor-1 by Degrading Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator: A Mechanism of Tumor Growth Inhibition". Molecular Pharmacology, 70 (5), p. 1664-1671.
8. Choi M-R, Stanton-Maxey KJ, Stanley JK, Levin CS, Bardhan R, Akin D, Badve S, Sturgis J, Robinson JP, Bashir R, Halas NJ, Clare SE (2007), "A Cellular Trojan Horse for Delivery of Therapeutic Nanoparticles into Tumors". Nano Letters, 7 (12), p. 3759-
3765.
9. de Ridder L (1997), "Autologous confrontation of brain tumor derived spheroids with human dermal spheroids". Anticancer research, 17 (6B), p. 4119-4120.
10. Donghui Jing, Lye T. Lock, Tzanakakis ES (2010), "Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture of Human Pluripotent Stem Cells ". Tissue Engineering, 16 (2).
11. Durand R (1976), "Cell Cycle Kinetics In An In Vitro Tumor Model". Cell Proliferation, 9 (5), p. 403-412.
12. Freshney, R.I (2005), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique".
Willey Blackwell, 5th edition.
13. Friedrich J, Ebner R, Kunz-Schughart LA (2007), "Experimental anti-tumor therapy in 3-D: Spheroids – old hat or new challenge?". International Journal of Radiation Biology, 83 (11-12), p. 849-871.
14. Friedrich J, Eder W, Castaneda J, Doss M, Huber E, Ebner R, Kunz-Schughart LA (2007), "A Reliable Tool to Determine Cell Viability in Complex 3-D Culture: The Acid Phosphatase Assay". Journal of Biomolecular Screening, 12 (7), p. 925-937.
15. Friedrich J, Seidel C, Ebner R, Kunz-Schughart LA (2009), "Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach". Nat. Protocols, 4 (3), p. 309-324.
16. Gurski LA, Jha AK, Zhang C, Jia X, Farach-Carson MC (2009), "Hyaluronic acid- based hydrogels as 3D matrices for in vitro evaluation of chemotherapeutic drugs using poorly adherent prostate cancer cells". Biomaterials, 30 (30), p. 6076-6085.
17. Hamer Philip C. De W, Jonker A, Leenstra S, Ruijter JM, Noorden CJFV (2005), "Quantification of Viability in Organotypic Multicellular Spheroids of Human Malignant Glioma using Lactate Dehydrogenase Activity: A Rapid and Reliable Automated Assay".
Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53 (1), p. 23-34.
18. Haycock JW (2010), "3D Cell Culture: A Review of Current Approaches and Techniques ". Spinger Protocol, Methods in Molecular Biolog 695 (p. 1-15.
19. Hirschhaeuser F, Menne H, Dittfeld C, West J, Mueller-Klieser W, Kunz- Schughart LA (2010), "Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again". Journal of Biotechnology, 148 (1), p. 3-15.
20. Ho WY, Yeap SK, Ho CL, Rahim RA, Alitheen NB (2012), "Development of Multicellular Tumor Spheroid (MCTS) Culture from Breast Cancer Cell and a High Throughput Screening Method Using the MTT Assay". PLoS ONE, 7 (9), p. e44640. 21. Hoai Nam N, Hong Ha Tran T, Duong Le Q, Toan Nguyen T, Nhu Hang Tran T, Mai Huong L, Phuong Thu H (2012), "Apoptosis induced by paclitaxel-loaded copolymer PLA–TPGS in Hep-G2 cells". Advances in Natural Sciences: Nanoscience
22. Ivascu A, Kubbies M (2006), "Rapid Generation of Single-Tumor Spheroids for High-Throughput Cell Function and Toxicity Analysis". Journal of Biomolecular Screening, 11 (8), p. 922-932.
23. Kavallaris M, Verrills NM, Hill BT (2001), "Anticancer therapy with novel tubulin-interacting drugs". Drug Resistance Updates, 4 (6), p. 392-401.
24. Kunz-Schughart LA, Freyer JP, Hofstaedter F, Ebner R (2004), "The Use of 3-D Cultures for High-Throughput Screening: The Multicellular Spheroid Model". Journal of
Biomolecular Screening, 9 (4), p. 273-285.
25. Kunz-Schughart LA, Kreutz M, Knuechel R (1998), "Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology". International Journal
of Experimental Pathology, 79 (1), p. 1-23.
26. Landry J, Bernier D, Ouellet C, Goyette R, Marceau N (1985), "Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities". The Journal of Cell Biology, 101 (3), p. 914-923. 27. Lee JS, Feijen J (2012), "Biodegradable polymersomes as carriers and release systems for paclitaxel using Oregon Green® 488 labeled paclitaxel as a model compound". Journal of Controlled Release, 158 (2), p. 312-318.
28. Lin R-Z, Chang H-Y (2008), "Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research". Biotechnology Journal, 3 (9-10), p. 1172-
1184.
29. Lu H-F, Lim WS, Wang J, Tang Z-Q, Zhang P-C, Leong KW, Chia SM, Yu H, Mao H-Q (2003), "Galactosylated PVDF membrane promotes hepatocyte attachment and functional maintenance". Biomaterials, 24 (27), p. 4893-4903.
30. Masters, J.R.W., (2002), "Cancer cell lines". Kluwer Academic Publishers, Vol. I, II, III.
31. Mayer B, Klement G, Kaneko M, Man S, Jothy S, Rak J, Kerbel RS (2001), "Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas". Gastroenterology, 121 (4), p. 839-852.
32. Minchinton AI, Tannock IF (2006), "Drug penetration in solid tumours". Nat Rev
33. Mu L, Feng SS (2003), "A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol®): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS". Journal of Controlled Release, 86 (1), p. 33-48.
34. Nicholson KM, Bibby MC, Phillips RM (1997), "Influence of drug exposure parameters on the activity of paclitaxel in multicellular spheroids". European Journal of
Cancer, 33 (8), p. 1291-1298.
35. Pampaloni F, Reynaud EG, Stelzer EHK (2007), "The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue". Nat Rev Mol Cell Biol, 8 (10), p. 839-845. 36. Phung YT, Barbone D, Broaddus VC, Ho aM (2011), "Generation of In Vitro Multicellular Spheroids for the Study of Monoclonal Antibody Therapy". Journal of cancer, p.
37. Ross DT, Perou CM (2001), "A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines". Disease Markers, 17 (2), p. 99-109. 38. Sato T, Katagiri K, Gohbara A, Inoue K, Ogonuki N, Ogura A, Kubota Y, Ogawa T (2011), "In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes".
Nature, 471 (7339), p. 504-507.
39. Shah N, Jin K, Cruz L-A, Park S, Sadik H, Cho S, Goswami CP, Nakshatri H, Gupta R, Chang HY, Zhang Z, Cimino-Mathews A, Cope L, Umbricht C, Sukumar S (2013), "HOXB13 Mediates Tamoxifen Resistance and Invasiveness in Human Breast Cancer by Suppressing ERα and Inducing IL-6 Expression". Cancer Research, 73 (17), p. 5449-5458.
40. Shi J, Orth JD, Mitchison T (2008), "Cell Type Variation in Responses to Antimitotic Drugs that Target Microtubules and Kinesin-5". Cancer Research, 68 (9), p. 3269-3276.
41. Smalley KSM, Haass NK, Brafford PA, Lioni M, Flaherty KT, Herlyn M (2006), "Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases". Molecular Cancer Therapeutics, 5 (5), p. 1136-
1144.
42. Soule HD, Vazquez J, Long A, Albert S, Brennan M (1973), "A Human Cell Line From a Pleural Effusion Derived From a Breast Carcinoma". Journal of the National Cancer Institute, 51 (5), p. 1409-1416.
43. Sutherland R, Carlsson J, Durand R, Yuhas J (1981), "Spheroids in Cancer Research". Cancer Research, 41 (7), p. 2980-2984.
44. Sutherland RM, MacDonald HR, Howell RL (1977), "Multicellular Spheroids: A New Model Target for In Vitro Studies of Immunity to Solid Tumor Allografts: Brief Communication". Journal of the National Cancer Institute, 58 (6), p. 1849-1853.
45. Sutherland RM, McCredie JA, Inch WR (1971), "Growth of Multicell Spheroids in Tissue Culture as a Model of Nodular Carcinomas". Journal of the National Cancer Institute, 46 (1), p. 113-120.
46. Takezawa T (2003), "A strategy for the development of tissue engineering scaffolds that regulate cell behavior". Biomaterials, 24 (13), p. 2267-2275.
47. Tammy T. Chang, Hughes-Fulford M (2008), "Monolayer and Spheroid Culture of Human Liver Hepatocellular Carcinoma Cell Line Cells Demonstrate Distinct Global Gene Expression Patterns and Functional Phenotypes ". Tissue Engineering, 15 (3), p. 48. Teicher, B.A. (1997), "Anticancer Drug Development Guide". p.
49. Teicher BA (2001), "Tumour Models in Cancer Research, Cancer Drug Discovery and Deverlopment". ed. B.A. Teicher, Human Press, New Jersey, p.
50. Thu HP, Quang DT, Trang MTT, Ha TTH, Nam NH, Phuc NX, Nguyet TTM, Thong PQ, Tuyet PTH, Oanh VTK, Huong LM (2013), "In Vitro Apoptosis Enhancement of Hep-G2 Cells by PLA–TPGS and PLA–PEG Block Copolymer Encapsulated Curcumin Nanoparticles". Chemistry Letters, 42 (3), p. 255-
257.
51. Tung Y-C, Hsiao AY, Allen SG, Torisawa Y-s, Ho M, Takayama S (2011), "High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array".
Analyst, 136 (3), p. 473-478.
52. Maltzahn G, Park J-H, Agrawal A, Bandaru NK, Das SK, Sailor MJ, Bhatia SN (2009), "Computationally Guided Photothermal Tumor Therapy Using Long-Circulating Gold Nanorod Antennas". Cancer Research, 69 (9), p. 3892-3900.
53. Ward Jp, King Jr (1997), "Mathematical modelling of avascular-tumour growth".
Mathematical Medicine and Biology, 14 (1), p. 39-69.
54. Wartenberg M, Budde P, de Marees M, Grunheck F, Tsang SY, Huang Y, Chen Z- Y, Hescheler J, Sauer H (0000), "Inhibition of Tumor-Induced Angiogenesis and Matrix-
Metalloproteinase Expression in Confrontation Cultures of Embryoid Bodies and Tumor Spheroids by Plant Ingredients Used in Traditional Chinese Medicine". Lab Invest, 83
(1), p. 87-98.
55. Wartenberg M, Dönmez F, Ling Fc, Acker H, Hescheler J, Sauer H (2001), "Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells". The FASEB Journal, 15 (6), p. 995-1005.
56. Wu F-Y, Sun M-Z, Xiang Y-L, Wu Y-M, Tong D-Q (2010), "Curcumin as a colorimetric and fluorescent chemosensor for selective recognition of fluoride ion".
Journal of Luminescence, 130 (2), p. 304-308.
57. Yen T. Phung, Dario Barbone, V. Courtney Broaddus, Ho1 M (2011), "Rapid Generation of In Vitro Multicellular Spheroids for the Study of Monoclonal Antibody Therapy ". J Cancer, 2), p. 507-514.
58. Yuhas JM, Tarleton AE, Molzen KB (1978), "Multicellular Tumor Spheroid Formation by Breast Cancer Cells Isolated from Different Sites". Cancer Research, 38
(8), p. 2486-2491.
59. Zang, R., Li D., Tang I.-C., Wang J., S.-T Y (2012), "Cell-Based Assays in High- Throughput Screening for Drug Discovery". International Journal of Biotechnologyfor WellnessIndustries, 1), p. pp. 31-51.
60. Zhang X, Wang W, Yu W, Xie Y, Zhang X, Zhang Y, Ma X (2005), "Development of an in Vitro Multicellular Tumor Spheroid Model Using Microencapsulation and Its Application in Anticancer Drug Screening and Testing".
Biotechnology Progress, 21 (4), p. 1289-1296.
61. Meerloo J, Kaspers GL, Cloos J (2011), Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay, Humana Press,
62. Hamilton G, Westmoreland C, George E (2001), "Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers". In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 37 (10), p. 656-667. 63. Hirschhaeuser F, Walenta S, Mueller-Klieser W (2010), "Efficacy of catumaxomab in tumor spheroid killing is mediated by its trifunctional mode of action".
64. Khaitan D, Chandna S, Arya MB, Dwarakanath BS (2006), "Establishment and characterization of multicellular spheroids from a human glioma cell line; Implications for tumor therapy". Journal of Translational Medicine, 4 (1), p. 1-13.
65. Lacroix M, Leclercq G (2004), "Relevance of Breast Cancer Cell Lines as Models for Breast Tumours: An Update". Breast Cancer Research and Treatment, 83 (3), p. 249- 289.
66. Laurent J, Frongia C, Cazales M, Mondesert O, Ducommun B, Lobjois V (2013), "Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D". BMC Cancer, 13 (1), p. 1-12.
67. Matsushita T, Nakano K, Nishikura Y, Higuchi K, Kiyota A, Ueoka R (2003), "Spheroid formation and functional restoration of human fetal hepatocytes on poly-amino acid-coated dishes after serial proliferation". Cytotechnology, 42 (2), p. 57-66.
68. Olive P, Durand R (1994), "Drug and radiation resistance in spheroids: cell contact and kinetics". Cancer and Metastasis Reviews, 13 (2), p. 121-138.
69. Shukla P, Khanna V, Ali MM, Khan MY, Srimal R (2008), "Anti-ischemic Effect of Curcumin in Rat Brain". Neurochemical Research, 33 (6), p. 1036-1043.
70. Wu L, Carlo D, Lee L (2008), "Microfluidic self-assembly of tumor spheroids for anticancer drug discovery". Biomedical Microdevices, 10 (2), p. 197-202.
71. "http://www.atcc.org/Products/Cells%20and%20Microorganisms/Cell%20Lines.a spx". 72. "http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/NCI/drugdiscovery". 73. "http://www.fda.gov/drugs/developmentapprovalprocess/howdrugsaredevelopedan dapproved/". 74. "http://www.fda.gov/drugs/resourcesforyou/consumers/ucm143534.htm". 75. "http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P22310".
MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 1.TỔNG QUAN ................................................................................................................... 3 1.1.Sàng lọc thuốc ............................................................................................................ 3 1.1.1.Quy trình sàng lọc thuốc ...................................................................................... 3
1.1.2.Các mơ hình sàng lọc thuốc tiền lâm sàng .......................................................... 5
1.2.Mơ hình ni cấy khối cầu đa bào ung thư .............................................................. 11
1.2.1.Nuôi cấy ba chiều (3D) ...................................................................................... 11
1.2.2.Mơ hình ni cấy khối cầu đa bào ung thư ....................................................... 13
1.2.3.Các vấn đề kĩ thuật liên quan tới nuôi cấy khối cầu đa bào .............................. 19
2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 27
2.1.Đối tượng nghiên cứu............................................................................................... 27
2.1.1.Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ......................................................................... 27
2.1.2.Hệ thuốc nano .................................................................................................... 28
2.1.3.Máy móc thiết bị và vật tư tiêu hao ................................................................... 28
2.2.Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 31
2.2.1.Hoạt hóa và nhân ni tế bào ............................................................................ 31
2.2.2.Gây tạo khối cầu đa bào ung thư ....................................................................... 31
2.2.3.Nghiên cứu động học sinh trưởng của khối cầu đa bào ung thư ....................... 33
3.KẾT QUẢ ....................................................................................................................... 40
3.1.Hoạt hóa và nhân ni dịng tế bào ung thư vú MCF-7 ........................................... 40
3.2.Gây tạo và nghiên cứu động học sinh trưởng của khối cầu đa bào ung thư MCF-7 41 3.2.1.Kết quả tạo khối cầu đa bào ung thư MCF-7 .................................................... 41
3.2.2.Động học và một số đặc điểm sinh trưởng của khối cầu đa bào ung thư MCF-7 .................................................................................................................................... 45
3.3.Thử nghiệm độc tính của ((Ptx-Cur)-Co .................................................................. 51
3.3.1.Độc tính trên mơ hình tế bào MCF-7 ni cấy đơn lớp .................................... 51
3.3.2.Độc tính trên mơ hình khối cầu đa bào ung thư MCF-7 .................................... 54
3.4.Sự xâm nhập của thuốc vào bên trong khối cầu đa bào ung thư MCF-7 ................. 66
4.BÀN LUẬN .................................................................................................................... 69
5.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 75
5.1.Kết luận .................................................................................................................... 75
5.2.Kiến nghị .................................................................................................................. 75
DANH MỤC HÌNH MINH HỌA
Hình 1. Thời gia trung bình cho một quy trình phát triển thuốc.. ....................................... 4
Hình 2. Ni cấy tinh hồn chuột để sản xuất tinh trùng in vitro.. ..................................... 6
Hình 3. Hai dạngtế bào ni cấy.. ....................................................................................... 8
Hình 4. Mơ hình gây u trên chuột hủy miễn dịch. ............................................................. 10
Hình 5. Các mơ hình ni cấy ba chiều -3D.. ................................................................... 12
Hình 6. Khối cầu đa bào ung thư vú MCF-7.. ................................................................... 13
Hình 7. Sự tương đồng trong cấu trúc các lớp tế bào và sự tương tác với các điều kiện mơi trường của mơ hình khối cầu đa bào ung thư (phải) khối u in vivo (trái) .................. 16
Hình 8. Phương pháp giọt treo (hanging drop).. ............................................................... 21
Hình 9. Các phương pháp nuôi cấy khối cầu đa bào động.. .............................................. 24
Hình 10. Tế bào MCF-7. ................................................................................................... 40
Hình 11. Sự bám dính của các tế bào MCF-7. .................................................................. 41
Hình 12. Sự liên kết của các tế bào MCF-7 trong giọt treo. ............................................. 42