2 .ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4 .Thử độc tính
2.2.4.1.Thử độc tính trên mơ hình ni cấy đơn lớp
Phương pháp MTT
Để thử độc tính của các chất trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 chúng tôi sử dụng bộ kit CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay của hãng Promega (gọi tắt là phương pháp MTT). Phương pháp MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) hiện nay được sử dụng rất phổ biến ở nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới. Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự khử hợp chất MTT màu vàng thành dạng tinh thể formazan màu tím trong tế bào sống [61]. Nồng độ formazan hình thành được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 500-600 nm. Q trình khử xảy ra dưới sự xúc tác của enzym trong ty thể trong tế bào sống, theo đó hàm lượng của chất tạo ra tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống tham gia phản ứng.
Phương pháp MTT có ưu điểm là độ nhạy và độ chính xác cao, các bước thực hiện đơn giản, trong thời gian ngắn, do đó thường sử dụng kiểm tra độc tính để sàng lọc thuốc với số lượng lớn, trên nhiều nồng độ thuốc khác nhau. Kết quả thu được cho ra giá trị IC50, từ đó đánh giá được độ độc của thuốc cần nghiên cứu.
Kit CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay được cung cấp bởi Promega gồm hai dung dịch là dung dịch nhuộm (Dye Solution) và hỗn hợp dung dịch hòa tan/dừng phản ứng (Solubilization Solution/Stop Mix).
Bố trí thí nghiệm
Chúng tơi tiến hành thử độc tính của 5 chất lên sự tăng sinh của dịng tế bào ung thư vú MCF-7 nuôi cấy đơn lớp gồm:
Paclitaxel kết hợp với curcumin bọc trong vỏ bọc copolymer PLA-TPGS ở kích thước nanomet ((Ptx-Cur)-Co).
Paclitaxel bọc trong vỏ bọc copolimer PLA-TPGS ở kích thước nanomet ((Ptx)- Co).
Paclitaxel thường (Ptx).
Curcumin thường (Cur).
Hỗn hơp paclitaxel trộn với curcumin (Ptx-Cur).
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi nồng độ thử nghiệm của từng chất trong mỗi thí nghiệm được lặp lại 4 lần, các nồng độ thử nghiệm được thể hiện cụ thể trong bảng. Các đối chứng sinh học (Control) là các khối cầu được phát triển trong điều kiện thường.
Bảng 4: Dải nồng độ paclitaxel thử nghiệm trên mơ hình ni cấy tế bào MCF-7
đơn lớp Chất Các nồng độ paclitaxel thử nghiệm (µm/ml) 1 2 3 4 5 (Ptx-Cur)-Co 2 0,4 0,08 0,016 0,0032 (Ptx)-Co 2 0,4 0,08 0,016 0,0032 Ptx 2 0,4 0,08 0,016 0,0032 Ptx + Cur 2 0,4 0,08 0,016 0,0032 Control 0 0 0 0 0
Bảng 5: Dải nồng độ curcumin thử nghiệm trên mơ hình ni cấy tế bào MCF-7 đơn lớp Chất Các nồng độ Curcumin thử nghiệm (µg/ml) 1 2 3 4 5 Ptx + Cur 5,2 1,04 0,21 0,04 0,008 Cur 5,2 1,04 0,21 0,04 0,008 Control 0 0 0 0 0 Quy trình thí nghiệm:
Nạp tế bào: tiến hành nạp tế bào vào trong các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng với nồng độ 5000 tế bào/180 µl mơi trường ni cấy, sau đó ủ trong 37oC, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24h trước khi tiến hành thử thuốc.
Ủ với thuốc thử: Bổ sung 20µl thuốc thử tương ứng để đạt nồng độ thuốc cần thiết. G nhẹ vào thành đĩa cho thuốc phân bố đều rồi ủ trong 48h ở trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
Sau 48h, hút bỏ 100 μl môi trường ở mỗi giếng và bổ sung vào 20 μl dung dịch nhuộm. G nhẹ đĩa và ủ trong 4h ở 37oC. Ở bước này, dung dịch cần được bọc kín để tránh ánh sáng.
Bổ sung vào giếng 100 μl hỗn hợp dung dịch hòa tan/dừng phản ứng, g nhẹ đĩa và ủ trong 1h.
Đo mật độ quang học của dung dịch trong giếng bằng máy Microplate Reader ở bước sóng 540 nm.
Dựa vào giá trị mật độ quang học, ta xác định được % tỷ số tăng sinh (A) của tế bào, từ đó đánh giá được độ độc đối với tế bào của chế phẩm. A được tính theo công thức:
A(%) = T
VH: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung mơi pha thuốc. T: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với thuốc.
Nếu A = 50% có nghĩa là thuốc có tác dụng gây độc và làm chết 50% tế bào. Nồng độ thuốc mà tại đó giá trị A đạt 50% gọi là liều gây chết 50% tế bào, k hiệu là IC50. Đây là giá trị để đánh giá độc tính của thuốc đối với tế bào. Phương pháp tính tốn giá tri IC50 được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit.
2.2.4.2.Thử độc tính trên mơ hình khối cầu đa bào ung thư Phương pháp đánh giá độc tính trên mơ hình khối cầu đa bào
Để nghiên cứu độc tính của các chất thử nghiệm trên mơ hình khối cầu đa bào ung thư, chúng tơi sử dụng quy trình của Juergen Friedrich, Leoni A Kunz-Schughart và các cộng sự kết hợp với việc sử dung bộ kit CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) nhằm theo d i các biến đổi trong hình thái, cấu trúc cũng như tốc độ tăng trưởng của các khối spheroid được điều trị theo thời gian cùng với việc xác định tỉ lệ tế bào chết và giá trị IC50 của từng chất thử nghiệm [15, 20].
Bố trí thí nghiệm
Chúng tơi lựa chọn thử độc tính của hai chất lên sự tăng sinh của khối cầu đa bào ung thư vú MCF-7:
Paclitaxel kết hợp với Curcumin bọc trong vỏ bọc copolymer PLA-TPGS ở kích thước nannomet ((Ptx-Cur)-Co).
Paclitaxel thường.
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần, mỗi nồng độ thử nghiệm của từng chất trong mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các nồng độ thử nghiệm được thể hiện cụ thể trong bảng. Các đối chứng sinh học (Control) là các khối cầu được sinh trưởng trong điều kiện bình
0.1% do paclitaxel khó tan trong mơi trường ni cấy nên chúng tơi phải sử dụng dung môi pha thuốc là DMSO (Dimethyl sulfoxide).
Bảng 6: Dải nồng độ paclitaxel thử nghiệm trên mơ hình khối cầu đa bào MCF-7
Chất Các nồng độ paclitaxel thử nghiệm (µg/ml) 1 2 3 4 5 (Ptx-Cur)-Co 2 0,4 0,08 0,016 0,0032 DMSO 0.1% 0 0 0 0 0 Control 0 0 0 0 0 Quy trình thí nghiệm
Gây tạo khối spheroid MCF-7 với nồng độ 5x103 tế bào/giọt treo.
Tiến hành chăm sóc các khối spheroid đã tạo được tới khi các khối cầu được 5 ngày tuổi, lựa chọn 39 khối có kích thước tương đồng phục vụ cho thử nghiệm.
Bổ sung các chất thử nghiệm vào các giếng theo như phần bố trí thí nghiệm để đạt được nồng độ phù hợp.
Tiến hành theo dõi (ghi lại hình ảnh) các biến đổi trong động học tăng trưởng của các khối cầu thử ngiệm so với đối chứng bắt đầu từ thời điểm ngày 0 (0h sau khi bổ sung thuốc vào các giếng nuôi cấy khối cầu đa bào).
Dừng thí nghiệm sau 8 ngày theo dõi (ngày 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7), tiến hành xác định độc tính bằng phương pháp MTT, giá trị IC50 được tính dựa vào phần mềm Microsoft Exel 2010 (theo hướng dẫn sử dụng bộ kit CellTiter 96® Non- Radioactive Cell Proliferation Assay của hãng Promega) kết hợp với kiểm tra trên phần mềm GraphPad Prism 5.
2.2.5.Nghiên cứu khả năng xâm nhập của thuốc vào mơ hình khối cầu đa bào
Tiến hành quan sát sự phân bố của (Ptx-Cur)-Co trong khối cầu đa bào ung thư theo quy trình sau:
Các khối cầu đa bào ung thư được điều trị với Ptx, (Ptx-Cur)-Co và Paclitaxel Oregon với nồng độ paclitaxel 2µg/ml.
Sau 24h, các khối cầu sẽ được thu từ các giếng nuôi cấy và chuyển lên các lam kính lõm.
Rửa để loại bỏ môi trường nuôi cấy và thuốc thử nghiệm bằng dung dịch PBS 1x khoảng 2-3 lần.
Bổ sung vào các lam kính lõm dung dịch PBS 1x để bảo quản các khối cầu
Tiến hành quan sát các mẫu trên dưới kính hiển vi laser quét đồng tụ LSM 510 dưới bước sóng kích thích 488nm.