3 .KẾT QUẢ
3.1 .Hoạt hóa và nhân ni dịng tế bào ung thư vú MCF-7
Tế bào ung thư vú dòng MCF-7 được bảo quản trong điều kiện nitơ lỏng sau khi được hoạt hóa sẽ được nuôi cấy bằng môi trường DMEM bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh, trong điều kiện 37o
C, 5% CO2, 95% khơng khí. Tế bào khi mới hoạt hóa có dạng trịn, trơi nổi trong mơi trường nuôi cấy, viền tế bào sáng rõ, một số tụ tập lại với nhau thành cụm nhỏ (Hình 10A).
Hình 10. Tế bào MCF-7.
(A) Tế bào khi mới hoạt hóa trơi nổi trong môi trường, dạng tròn, viền sáng rõ, phân bố tương đối đều trong môi trường nuôi cấy, tỉ lệ tế bào sống cao. (B) Tế bào sau 4 ngày nuôi cấy bao phủ khoảng 80% bề mặt đĩa nuôi cấy. Các tế bào bám dính khỏe mạnh và đạt mật độ thích hợp cho các thí nghiệm. Bar=50µm
Với thời gian phân chia 29h, sau 3-4 ngày nuôi cấy ổn định, số lượng tế bào tăng lên đáng kể, bao phủ phần lớn diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy. Các tế bào liên kết rất chặt chẽ tạo thành từng đám tế bào lớn bám trên bề mặt nuôi cấy chứ không tạo thành từng tế bào riêng rẽ (Hình 10B). Sự liên kết tế bào - tế bào rất mạnh là một đặc trưng của dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và đây cũng là một yếu tốt quan trọng giúp cho sự hình thành khối cầu đa bào từ dịng tế bào này thuận lợi hơn.
3.2.Gây tạo và nghiên cứu động học sinh trưởng của khối cầu đa bào ung thư MCF-7
3.2.1.Kết quả tạo khối cầu đa bào ung thư MCF-7
3.2.1.1.Kết quả xử lý bề mặt đĩa
Việc phủ agarose lên bề mặt đĩa nuôi cấy cho phép ngăn cản sự tiếp xúc của tế bào với bề mặt đĩa ni cấy và do đó tạo điều kiện cho các tế bào liên kết lại với nhau trong môi dung dịch khi trơi nổi. Quan sát Hình11, ta có thể thấy ở phần giếng của đĩa ni cấy 96 khơng có phủ agarose, các tế bào bám dính chặt trên nền đĩa nên chỉ tạo thành đơn lớp tế bào. Trong khi đó, với các nền giếng được phủ bằng agarose, các tế bào không bám được mà tụ tập lại với nhau thành các cụm tế bào trơi nổi trong mơi trường.
Hình 11. Sự bám dính của các tế bào MCF-7.
(A) Hình ảnh bám dính của các tế bào MCF-7 trên nền đĩa nuôi cấy thông thường. (B) Các tế bào MCF-7 khơng thể bám dính trên nền đĩa có phủ agarose nên tụ tập lại thành đám trơi nổi trong mơi trường.Bar=50µm
3.2.1.2.Kết quả tạo giọt treo
được kết quả như Hình 12. Có thể thấy ở hầu hết các giọt treo, các đám tế bào đã liên kết với nhau một cách chắc chắn và có thể hạ xuống các giếng ni cấy đã có phủ agarose và tiến hành ni cấy.
Hình 12. Sự liên kết của các tế bào MCF-7 trong giọt treo.
(A) Các tế bào phân bố đều trong giọt treo tại thời điểm 0h sau khi tạo giọt. (B) Các khối tế bào tụ tập trong giọt treo sau 24h. (C) Các đám tế bào tụ tập thành khối duy nhất sau 36h. Bar=50µm
Tỉ lệ hình thành các khối tế bào duy nhất bên trong các giọt treo sau 24-36h treo giọt dung dịch tế bào được thể hiện trong bảng 7.
Bảng 7: Tỉ lệ tạo khối tế bào duy nhất bên trong các giọt treo sau 36h
Thí nghiệm Số giọt treo Số khối tế bào Tỉ lệ (%)
1 96 92 95,8 2 96 92 95,8 3 96 93 96,9 4 96 92 95,8 5 96 94 97,9 6 96 96 100
7 96 96 100
8 96 94 97.9
TB (α=0.01) 96,2±3,9
3.2.1.3.Kết quả tạo khối cầu đa bào ung thư
Chúng tôi gây tạo thành công khối cầu đa bào trên tất cả các nồng độ tế bào/giọt treo được nêu ở phần phương pháp nghiên cứu là 103; 2,5x103; 5x103; 104; 2x104 tế bào/giọt (Hình 13). Giọt treo sau khi được hạ xuống giếng vẫn giữ được cấu trúc chắc chắn, các tế bào trong khối liên kết chặt chẽ, phân chia bình thường làm tăng kích thước của khối cầu theo thời gian, các khối cầu đa bào sinh trưởng ổn định có dạng gần cầu với các đường kính khơng có khác biệt lớn.
Hình 13. Các khối cầu đa bào ung thư MCF -7 tạo thành ở các nồng độ tế bào khác
nhau trên mỗi giọt treo. Bar=200µm.
phân chia mạnh nhất, còn được gọi là lớp sinh trưởng. Lớp này mỏng, thường gồm khoảng 2 hàng tế bào. Lớp giữa (hay còn gọi là lớp trung gian, lớp ổn định) gồm những tế bào vẫn sống nhưng đã ngừng phân chia. Bằng phương pháp nhuộm xanh trypan có thể phân biệt rõ ba lớp cấu trúc này trên kính hiển vi (Hình 14). Lớp trong cùng còn gọi là vùng lõi họai tử. Đây là vùng gồm các tế bào yếu hoặc chết. Sự phân chia như trên cũng chỉ mang tính chất tương đối vì giữa các lớp tế bào thường có những vùng chuyển tiếp tức là tế bào có thể tồn tại dạng trung gian.
Hình 14. Khối spheroid dịng tế bào ung thư vú MCF -7 được gây tạo với nồng độ 5x103 tế bào/giọt treo.
(A)Spheroid ngày thứ 3 chụp trên nền agarose; (B)Spheroid ngày thứ 8, lõi hoại tửbắt mầu
xanh khi nhuộm với xanh trypan. 1: Lớp sinh trưởng; 2: lớp trung gian;3: lõi hoại tử. Bar=200µm
Tỉ lệ tạo thành khối cầu đa bào bằng phương pháp giot treo qua một số lần thực hiện được thể hiện cụ thể trong bảng 8.
Bảng 8: Tỉ lệ tạo khối cầu đa bào bằng phương pháp giọt treo
Thí nghiệm Số giọt treo Số khối cầu tạo thành Tỉ lệ (%)
1 96 78 81,2 2 96 84 87,5 3 96 82 85,4 4 96 86 89,6 5 96 79 82,3 6 96 85 88,5 7 96 91 94,8 8 96 87 90,6 TB (α=0.01) 87,5±4,5
3.2.2.Động học và một số đặc điểm sinh trưởng của khối cầu đa bào ung thư MCF-7
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu động học tăng trưởng của các khối spheroid được gây tạo với mật độ 5x103tế bào/giọt treo.
3.2.2.1.Động học tăng trưởng
Hình 15 thể hiện sự biến đổi kích thước khối spheroid theo thời gian, từ lúc mới được hình thành, trải qua quá trình tăng trưởng, đạt cực đại, sau đó bắt đầu giảm dần và có thể bị vỡ ra.
Hình 15. Sự thay đổi hình dạng và kích thước spheroid và lõi hoại tử theo thời gian
(ngày tuổi của khối cầu được thể hiện ở góc trái ảnh). Bar=200µm
Q trình tăng trưởng của khối spheroid diễn ra trong khoảng 28-30 ngày. Trong đó, từ ngày thứ 15-19, khối spheroid đạt thể tích cực đại. Từ ngày thứ 21 trở đi, kích thước khối bắt đầu giảm dần (Hình 15). Trong khoảng thời gian từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7, sự tăng trưởng kích thước khối spheroid diễn ra mạnh nhất với tốc độ tăng thể tích so với thời điểm trước (các thời điểm theo dõi cách nhau 48h) lên tới trên 240%. Trong giai đoạn tiếp theo từ ngày 7-21, thì quá trình tăng trưởng diễn ra chậm hơn nhưng tương đối ổn định, sự tăng trưởng duy trì ở mức 20±0,08%. Qua ngày 21, tăng trưởng bắt đầu có giá trị âm hay nói cách khác là thể tích khối spheroid bắt đầu suy giảm.
Hình thái cấu trúc khối spheroid cũng thay đổi rõ nét. Spheroid dòng MCF-7 ở những ngày đầu khá nhỏ, các tế bào liên kết thành một khối rất chắc chắn. Chúng có tốc độ tăng trưởng khá nhanh ở những ngày đầu (đặc biệt là từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 5). Trong giai đoạn này, khối chỉ gồm các tế bào sống có khả năng tăng sinh mạnh mẽ, liên kết chặt chẽ, vành ngồi r nét. Sau đó là giai đoạn tăng trưởng ổn định (từ ngày 7-21), có sự phân vùng tế bào theo ba lớp rõ ràng. Ở giai đoạn này các spheroid cũng bắt đầu
hình thành các lõi hoại tử. Do ánh sáng khơng thể xuyên qua được khối nhân kết đặc của lõi hoại tử nên khi nhìn qua kính hiển vi quang học thơng thường thì sẽ thấy vùng lõi hoại tử này có màu đen. Cuối giai đoạn này, có hiện tượng các tế bào vùng lõi bị đẩy ra khỏi khối spheroid. Giai đoạn cuối (từ sau ngày 22), sự tách ra khỏi khối của các tế bào diễn ra mạnh mẽ hơn và cuối cùng dẫn đến sự vỡ khối (Hình 17).
3.2.2.2.Động học phát triển lõi hoại tử
Sự phân chia thành các lớp tế bào đóng vai trị hết sức quan trọng trong nghiên cứu điều trị ung thư. Các thuốc ức chế tăng sinh sẽ liên quan nhiều đến vịng ngồi của khối u. Sự kháng thuốc lại liên quan nhiều đến lớp trung gian. Vùng lõi hoại tử là vùng mà thiếu sự cung cấp oxy và máu nuôi dưỡng. Do vậy các tế bào thuộc ranh giới vùng lõi và vùng trung gian thường có khả năng di căn mạnh mẽ. Vùng lõi còn tiết ra các chất kích thích sự tăng sinh mạch máu cho khối u. Do đó những nghiên cứu về vùng lõi hoại tử rất đáng được quan tâm. Hơn nữa, đối với việc thử chế phẩm, thông thường thời điểm để thử thuốc là khi chưa hoặc bắt đầu xuất hiện lõi hoại tử vì như vậy mới có thể đánh giá chính xác hiệu lực của chất. Với những nhận định trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu động học lõi hoại tử của dòng tế bào MCF-7.
Lõi hoại tử với đa số là các tế bào chết do tình trạng thiếu dinh dưỡng và oxy ở phần trung tâm của khối spheroid . Chúng tôi nhận thấy vùng lõi hoại tử màu đen bắt đầu xuất hiện từ ngày thứ 6-8. Ban đầu chỉ là một vùng đậm hơn ở vùng giữa khối spheroid. Sau đó kích thước lõi hoại tử cũng tăng dần theo kích thước của spheroid. Đến ngày thứ 21-22 vùng l i đạt kích thước lớn nhất. Hình ảnh về spheroid cũng cho thấy đường viền của spheroid đã bị mờ đi trông thấy, hơn nữa đã bắt đầu thấy những tế bào nhỏ xung quanh khối spheroid. Đây là những biểu hiện của spheroid bước vào giai đoạn thoái lui sinh khối, spheroid bắt đầu yếu đi, sinh trưởng chậm, sau giai đoạn này sẽ có sự biến động mạnh cả về thể tích, hình dạng, đường kính,… Những ngày cuối của đợt thí nghiệm
đám đen mờ lan sang vùng trung gian. Đây có thể là những hạt nhân tương lai của vùng hoại tử mới. Điều này cũng đi cùng với sự suy giảm về thể tích khối spheroid. Sự xuất hiện của lõi hoại tử và kích thước của vùng này thể hiện đặc điểm sinh trưởng rất phù hợp với những biến động về thể tích, đường kính, sinh trưởng của spheroid.
Hình 16 biểu diễn hai đường đồ thị có sự tương đồng cao thể hiện mức độ tuyến tính cao giữa sự biến đổi kích thước chung của khối spheroid và kích thướccủa lõi hoại tử hay cũng có thể nói là sự phụ thuộc chặt chẽ giữa hai giá trị này.Với hệ số tương quan là R2 = 0,989 (hệ số này càng gần 1 thì mức độ phụ thuộc càng sâu sắc, hệ số lớn hơn 0.7 được coi là có phụ thuộc), ta xây dựng được phương trình đường hồi quy tuyến tính. Phương trình này cho phép dự đốn tình trạng, thể tích lõi hoại tử khi đã xác định được thể tích khối spheroid và ngược lại. Điều này cho phép giảm bớt thao tác trong nghiêm cứu mà vẫn thu được lượng thông tin và số liệu cần thiết.
3.2.2.3.Mức độ cầu và khả năng cầu hóa
Spheroid dịng MCF-7 có hình dạng cầu phổ biến và tương đối đồng đều. Để xác định mức độ cầu của spheroid dịng MCF-7, chúng tơi tiến hành xác định chỉ số a/b (giá trị này càng gần một thì càng có mức độ cầu cao) với:
a-Đường kính nhỏ nhất (µm)
b-Đường kính lớn nhất (µm)
Với spheroid dịng MCF-7, chỉ số a/b thường ở mức độ trên 0,9 tức là có mức độ cầu rất cao. Đặc biệt trong giai đoạn từ ngày thứ 7-8 đến ngày thứ 21-22 thì tỉ số a/b ln duy trì ở mức 0,98±0,002. Trong những giai đoạn mà khối spheorid khác với dạng cầu nhất thì con số này cũng vào khoảng 0,88±0,076 (Hình 18).
Hình 17. Sự thay đổi hình dạng trong quá trình tăng trư ởng của spheroid. Bar=200µm
Trong q trình tăng trưởng của mình, spheroid dịng MCF-7 có khả năng biến dổi dần về dạng cầu dù hình dạng ban đầu khi mới hạ giọt treo khác nhiều so với dạng cầu, tạm goi là khả năng cầu hóa (Hình 17, 18).
Hình 18. Sự thay đổi tỷ lệ giữa đường kính nhỏ nhất /đường kính l ớn nhất của spheroid(a/b) theo thời gian.
Có thể nhận thấy rằng trong giai đoạn từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7-8 có sự tăng dần của tỉ số a/b đến khi đạt cực đại vào ngày thứ 9-10 (lớn hơn 0,98) thì khối spheroid duy trì dạng cầu của nó ổn định trong suốt q trình tăng trưởng cho đến khi đạt thể tích lớn nhất vào ngày thứ 20-21. Sau đó, cùng với q trình suy giảm kích thước và biến đổi hình dạng của spheroid là sự giảm dần của tỉ số a/b (Hình 18).
3.2.2.4.Sự đào thải lõi hoại tử khi khối spheroid đạt kích thước cực đại
Khi khối spheroid đã đạt đến kích thước tối đa thì nó bước vào q trình suy giảm và bắt đầu vỡ ra. Quá trình này bắt đầu bằng sự thay đổi và mất đi hình dạng cầu đặc trưng; sau đó lớp vỏ ngồi (các tế bào sống) vỡ một phần, lõi hoại tử theo chỗ vỡ bị đẩy dần ra ngồi (Hình 19). Nếu môi trường thiếu dinh dưỡng, các tế bào trong lớp vỏ sẽ tách rời ra, khối spheroid hồn tồn phân rã. Nếu mơi trường vẫn đảm bảo dinh dưỡng, lớp vỏ
0.8 0.84 0.88 0.92 0.96 1 1.04 3 7 11 15 19 23 27 Ngày tuổi Tỉ lệ a/b a/b
sẽ liên kết lại tạo thành một spheroid mới có kích thước nhỏ và sau đó khối spheroid tiếp tục tăng sinh bình thường.
Q trình đào thải lõi hoại tử giải thích một phần sự giảm kích thước của lõi hoại tử và của cả khối spheroid trong giai đoạn sau khi chúng đạt đến thể tích cực đạị. Tuy nhiên khả năng tái tạo lại khối spheroid không cao, chiếm khoảng 60% tổng số sheroid. Đây là một đặc điểm rất thú vị của nuôi cấy 3D. Điều này cho thấy các tế bào ung thư trong khối u có khả năng thích nghi cao với các điều kiện ni cấy để duy trì sự sinh tồn và phát triển. Đây cũng sẽ là một đối tượng nghiên cứu các thuốc có khả năng ức chế sự tái tạo/tái phát triển khối u.
Hình 19. Sự đào thải lõi hoại tử của khối spheroid MCF-7.
(A) Sự đào thải lõi qua vị trí bị vỡ trên viền khối cầu đa bào lần thứ nhất dẫn tới kích thước khối giảm, kích thước lõi hoại tử giảm. (B) Sự đào thải lõi lần thứ hai với kết quả hình thành khối cầu đa bào mới khơng cịn lõi hoại tử. Bar=200µm