Kết quả so sánh trình tự trên GenBank cho thấy: trình tự 16s rADN của VNC1 có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự có SĐK KT261215, KR265147, KT261212..., trình tự 16s rADN của VNC53 có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự có SĐK AB68129, NR074949, KJ531389..., trình tự 16s rADN của VNY3 có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự có SĐK HM058749, HM058894, FR725449...
Sử dụng các trình tự 16S rADN đã xác định đƣợc của các chủng nghiên cứu và các trình tự tƣơng đồng 100% với chúng trên GenBank, tiến hành căn trình tự và so sánh trình tự đa chuỗi sử dụng phần mềm ClustalX2 2.0. Sau đó xây dựng cây phát sinh loài bằng phƣơng pháp Neighbour-Joining với trị số Bootstrap 100.
Từ kết quả phân tích cây phát sinh lồi (Hình 3.3) và so sánh tƣơng đồng trình tự 16S rADN, đề tài đã định danh đƣợc chủng VNC1 thuộc loài phụ
Lactococcus lactis subsp. lactis, chủng VNC53 thuộc loài phụ Lactococcus lactis subsp. cremoris và chủng VNY3 thuộc lồi Streptococcus thermophilus.
Hình 3.3. Cây phát sinh lồi của LAB dựa vào trình tự nucleotide 16S rADN. 3.2.2. Khả năng sử dụng các nguồn đƣờng
Phổ sử dụng các loại đƣờng của chủng khởi động là một đặc điểm cần đƣợc mơ tả. Điều này có ý nghĩa trong việc nghiên cứu kết hợp chủng để tạo hỗn hợp giống khởi động và công nghệ lên men tạo sinh khối của mỗi chủng. Do đó, tiến hành khảo sát khả năng sử dụng 49 loại đƣờng khác nhau theo bộ kit API 50CHL. Sinh khối của mỗi chủng thu từ đĩa thạch, đƣợc tái huyền phù trong ống Suspension Medium của bộ kit, để đạt đƣợc độ đục là 2 McFarland. Sau đó, dịch này đƣợc nhỏ vào các giếng trên bộ kit để kiểm tra khả năng sử dụng đƣờng. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.5:
Kết quả trên cho thấy, chủng VNC1, VNC53 có phổ sử dụng nguồn đƣờng rộng. Trong đó, sử dụng tốt các loại đƣờng galactose, glucose, fructose, mannose, N – Acetyl – Glucosamine, lactose, trehalose, gentiobiose. Trong khi đó, chủng VNY3 chỉ lên men đƣợc glucose và lactose. Chủng VNY3 sử dụng đƣợc lactose nhƣng
không sử dụng đƣợc galactose, do vậy, galactose giải phóng ra từ lactose đƣợc tích tụ trong mơi trƣờng. Trong khi đó, chủng VNC1 và VNC53 sử dụng tốt galactose. Khi kết hợp chủng ƣa ấm và ƣa nhiệt này để lên mem sữa thì sẽ khơng có sự cạnh tranh về dinh dƣỡng. Hơn nữa, sự kết hợp này còn tạo ra ƣu điểm là sử dụng triệt để các nguồn đƣờng, hạn chế sự phát triển của hệ vi sinh vật khơng đóng vai trị là giống khởi động.
Bảng 3.5. Khả năng sử dụng đƣờng của 3 chủng nghiên cứu
STT Đƣờng Chủng VNY3 VNC1 VNC53 24h 48h 24h 48h 24h 48h 0 Control - - - - - - 1 Glycerol - - - - - - 2 Erythritol - - - - - - 3 D- Arabinose - - - - - - 4 L- Arabinose - - - - - - 5 Ribose - - + + - - 6 D- Xylose - - (+/-) (+/-) - - 7 L- Xylose - - - - - - 8 Adonitol - - - - - - 9 β Methyl - D- Xyloside - - - - - - 10 Galactose - - + + + + 11 Glucose (+/-) + + + + + 12 Fructose - - + + + + 13 Mannose - - + + + + 14 Sorbose - - - - - - 15 Rhamnose - - - - - - 16 Dulcitol - - - - - - 17 Inositol - - - - - - 18 Mannitol - - - - (-/+) (-/+) 19 Sorbitol - - - - - - 20 α - Metyl -D-Mannoside - - - - - - 21 α - Metyl -D-Glucoside - - - - - - 22 N - Acetyl-Glucosamine - - + + + + 23 Amygdalin - - (+/-) (+/-) - - 24 Arbutin - - (+/-) (+/-) - -
STT Đƣờng Chủng VNY3 VNC1 VNC53 24h 48h 24h 48h 24h 48h 25 Esculin - - (+/-) + (-/+) + 26 Salicin - - + + - - 27 Cellobiose - - + + - (+/-) 28 Maltose - - + + - - 29 Lactose (+/-) + + + + + 30 Melibiose - - - - - - 31 Sucrose - - - - - - 32 Trehalose - - + + + + 33 Inulin - - - - - - 34 Melezitose - - - - - - 35 Raffinose - - - - - - 36 Starch - - (+/-) (+/-) - - 37 Glycogen - - - - - - 38 Xylitol - - - - - - 39 Gentiobiose - - + + (+/-) (+/-) 40 D- Turanose - - - - - - 41 D- Lyxose - - - - - - 42 D- tagatose - - - - - - 43 D- Fucose - - - - - - 44 L- Fucose - - - - - - 45 D-Arabitol - - - - - - 46 L- Arabitol - - - - - - 47 Gluconate - - - - - - 48 2-keto- Gluconate - - - - - - 49 5- keto- Gluconate - - - - - -
Ký hiệu: (+) lên men tốt – giếng có màu vàng; (+/-) lên men khá – giếng có màu hơi vàng; (- /+) lên men yếu – giếng chuyển màu; (-) không sử dụng – giếng giữ ngun màu mơi trường.
3.2.3. Phổ hoạt tính enzym
Tiến hành khảo sát hoạt tính của 19 enzym theo bộ kit API ZYM. Dịch enzym nội bào thu đƣợc sau khi phá tế bào, sinh khối thu từ đĩa thạch đã ni cấy 48 giờ ở nhiệt độ thích hợp và dịch enzym ngoại bào thu đƣợc từ dịch sữa đã lên men bởi các chủng trên đƣợc dùng để khảo sát phổ enzym. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.6:
Bảng 3.6. Phổ hoạt tính enzym của các chủng nghiên cứu STT Enzym STT Enzym Hoạt tính enzym (*) VNY3 VNC1 VNC53 Nội bào Sinh khối Nội bào Sinh khối
Nội bào Sinh khối 1 Đối chứng 0 0 0 0 0 0 2 Alkaline phosphatase 2 0 2 1 2,5 2 3 Esterase (C4) 0 2 2 1 2 1 4 Esterase lipase (C8) 1 0 1 1 1,5 2 5 Lipase (C14) 0 0 1 1 1 1 6 Leucine arylamidase 5 5 3 3 3 5 7 Valine arylamidase 2 1 1 1 1 1 8 Cystine arylamidase 0.5 0 1 1 1 1 9 Trypsin 0 0 1 1 1 0 10 α -chymotrypsin 3 1 1 1 1 0 11 Acid phosphatase 1 1 4 4 5 5 12 Naphthol - AS - BI - phosphohydrolase 1 1 1 1 1 2 13 α- galactosidase 0 0 1 1 0 0 14 β-galactosidase 5 1 1 1 0 1 15 β-glucuronidase 0 0 0 0 0 0 16 α - glucosidase 0 0 0 1 1 1 17 β-glucosidase 0 0 0 0 0 1 18 N-acetyl -β - glucosaminidase 0 0 1 0 1 0 19 α-mannosidase 0 0 0 1 0 0 20 α-fucosidase 0 0 0 1 1 1
(*) Ký hiệu: hoạt lực enzym định tính bằng màu sắc, chia theo thang điểm từ 0 – 5. Trong đó, 0: được xem là âm tính, 0,5 – 2: hoạt lực yếu, 3 – 5: hoạt lực mạnh.
Kết quả cho thấy, cả 3 chủng này đều không sinh tổng hợp enzyme β- glucuronidase. Theo các tác giả Bassyouni và cs. (2012) [15] và Ling và cs. (1994) [39] thì enzyme β-glucuronidase có liên quan tới bệnh ung thƣ do có thể giải phóng ra các chất độc hại đối với cơ thể và khơng đƣợc phép có ở những chủng đƣợc tuyển chọn là chủng probiotic.
Các enzyme phân giải lipit nhƣ esterase (C4), esterase lipase (C8) đều có ở 3 chủng nhƣng hoạt lực khơng mạnh. Hoạt lực của lipase (C14) chỉ có ở hai chủng ƣa
ấm và ở mức độ yếu. Hoạt lực của trypsin cũng chỉ thể hiện ở hai chủng ƣa ấm với mức độ yếu, ngƣợc lại, hoạt lực của α –chymotrypsin lại mạnh ở chủng ƣa nhiệt VNY3 và không đƣợc biểu hiện ở hai chủng ƣa ấm.
Hoạt lực của enzyme leucine arylamidase đều mạnh ở cả 3 chủng, ngƣợc lại hoạt lực của 2 enzyme valine arylamidase và cysteine arylamidase ở 3 chủng đều yếu. Đây là các aminopeptidase.
Cả 3 chủng đều biểu hiện hoạt tính axit phosphatase tuy nhiên hoạt tính ở hai chủng ƣa ấm mạnh còn chủng ƣa nhiệt yếu. Hoạt tính naphthol – AS – BI – phosphohydrolase và alkaline phosohatase yếu ở cả 3 chủng.
Hoạt tính β-galactosidase nội bào đều có ở 3 chủng nhƣng chủng VNY3 thể hiện hoạt tính mạnh trong khi hai chủng cịn lại thể hiện hoạt tính rất yếu. Điều này cho thấy chủng VNY3 có khả năng lên men lactose nhanh hơn 2 chủng còn lại.
3.2.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến khả năng sinh trƣởng của các chủng
Trong sản xuất phomat cũng nhƣ lên men thu sinh khối, nhiệt độ và pH là những yếu tố môi trƣờng quyết định hiệu suất của quá trình sản xuất vì vậy cần đƣợc tối ƣu hóa. Tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH tới khả năng sinh trƣởng của 3 chung VNC1, VNC53 và VNY3. Các chủng đƣợc cấy trên đĩa thạch, nuôi ở các dải nhiệt độ khác nhau và ở pH khác nhau. Khả năng thích nghi với nhiệt độ và pH của mỗi chủng đƣợc đánh giá dựa vào kích thƣớc khuẩn lạc trên đĩa thạch sau 48h nuôi cấy. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.7 và 3.8.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ: qua kết quả đánh giá sơ bộ khả năng phát triển của các chủng ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy, 2 chủng VNC1 và VNC53 là hai chủng ƣa ấm, có khả năng phát triển ở dải nhiệt độ từ 15- 37oC và phát triển tối ƣu từ 28-37oC. Chủng VNY3 là chủng ƣa nhiệt, phát triển trong dải nhiệt độ từ 28- 45oC trong đó phát triển tối ƣu ở dải nhiệt độ từ 30-45o
chủng ƣa ấm và ƣa nhiệt làm giống khởi động, để 2 chủng đều sinh trƣởng tốt, nhiệt độ môi trƣờng nên chọn trong khoảng 30-37o
C.
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng
Tên chủng 15oC 28oC 30oC 37oC 45oC
VNY3 - -/+ + + +
VNC 53 +/- + + + -
VNC1 +/- + + + -
Ảnh hƣởng của pH: kết quả đánh giá cho thấy, cả 3 chủng khảo sát có khả năng phát triển khi pH ban đầu kiềm tính ở pH 8,6. Khi mơi trƣờng ban đầu có giá trị pH 5,0, các chủng ƣa ấm phát triển kém hoặc khơng có khả năng phát triển đƣợc, chủng ƣa nhiệt VNY3 vẫn có khả năng phát triển tốt. Tuy nhiên, khi pH xuống đến 4 thì cả 3 chủng này đều khơng có khả năng phát triển.
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng Tên chủng pH 4,0 pH 5,0 pH 8,6 pH 9,6 Tên chủng pH 4,0 pH 5,0 pH 8,6 pH 9,6 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h VNY3 - - + + + + - + VNC 53 - - - - + + - + VNC1 - - - - + + - (-/+)
3.3. Phối hợp các chủng giống trong lên men đông tu ̣ sƣ̃a làm phomat
Tƣ̀ các kết nghiên cƣ́u các đă ̣c điểm củ a chủng giống LAB sƣ̉ du ̣ng làm giống khởi đô ̣ng, đề tài đã lựa chọn đƣợc hai chủng ƣa ấm Lactococcus VNC1 và VNC53
cùng với một chủng ƣa nhiê ̣t Streotococcus VNY3 có hƣơng thơm tớt phù hơ ̣p thi ̣ hiếu ngƣời tiêu dùng Viê ̣t có các đă ̣c tính tốt để nghiên cƣ́u phối trô ̣n các chủng giống LAB làm giống khởi đô ̣ng lên men phomat.
3.3.1. Ảnh hƣởng của mật độ giống tới thời gian đông tụ sữa
Trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa, mật độ giống khởi động quyết định tới thời gian đơng tụ sữa. Do đó, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của mật độ tiếp giống ban đầu tới thời gian đông tụ sữa của các chủng
VNC1, VNC53 và VNY3. Chủng VNC1 đƣợc tiếp giống vào sữa ở với các mật độ ban đầu là: 8,07x104
, 8,07x105, 8,07x106 (CFU/ml), chủng VNC53, mật độ ban đầu lên men sữa là: 3,25x105, 9,33x105 và 9,33x106 CFU/ml, chủng VNY3 với mật độ tiếp giống ban đầu là: 3,02x105 và 3,02x106
CFU/ml. Nhiệt độ lên men chủ ng VNC1 và VNC53 là 30ºC, chủng VNY3 ở nhiệt độ 42oC.
Từ Hình 3.1 ta thấy, mật độ ban đầu của sữa lên men bởi chủng VNC1 càng cao thì thời gian đông tụ càng ngắn. Với mật độ ban đầu là 8,07x106
(CFU/ml), sữa đông tụ sau 6h (pH đạt 4,81), trong khi đó với mật độ 8,07x105 (CFU/ml) thời gian đông tụ là 10h (pH 4,71) và mật độ 8,07x104 (CFU/ml) thì sau 12h chƣa thấy đơng tụ. Trong thời gian đầu của quá trình lên men, sự thay đổi pH ở mật độ 8,07x106 (CFU/ml) diễn ra một cách nhanh chóng và rõ ràng nhất, các mật độ 8,07x105 (CFU/ml) và 8,07x104 (CFU/ml) không rõ ràng khoảng 0h – 5h, thời gian sau phát triển mạnh, ƣu thế lên men bởi lƣợng mật độ tiếp giống đƣợc thể hiện. Nhƣ vậy, đối với VNC1, thời gian sữa đƣợc đông tụ phụ thuộc rất nhiều vào mật độ giống ban đầu đƣợc cấy vào.