2.5.3.1. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục
Mật độ vi sinh vật có thể xác định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục. Khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử khơng tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trƣờng cũng làm cho môi trƣờng trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập đƣợc quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục. Do vậy có thể định lƣợng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở bƣớc sóng λ= 600nm. Trong trƣờng hợp này trƣớc tiên cần thiết lập đƣợc đƣờng quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách sử dụng một số huyền phù tế bào có độ đục xác định và mật độ tế bào của mỗi huyền phù đƣợc xác định bằng một phƣơng pháp trực tiếp khác.
Bƣớc 1: Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào.
Hỗn dịch A: bao gồm dung dịch môi trƣờng lên men và sinh khối vi sinh vật. Hỗn dịch A có thể pha lỗng ở các nồng độ khác nhau.
Dung dịch B: dung dịch nhƣ môi trƣờng lên men đối chứng sử dụng ở trên, pha loãng ở các nồng độ tƣơng ứng với hỗn dịch A.
Hỗn dịch A và dung dịch B đƣợc xác định giá trị OD ở bƣớc sóng λ= 600nm. Dùng phƣơng pháp đếm trực tiếp dƣới kính hiển vi hoặc phƣơng pháp trang cấy trên đĩa thạch để xác định mật độ tế bào trong hỗn dịch A.
Giá trị độ đục của sinh khối vi sinh vật = giá trị OD của hỗn dịch A – giá trị OD của dung dịch B. Dựng đƣờng cong chuẩn giữa giá trị OD và mật độ tế bào có dạng: y= ax +b
Trong đó:
Y: Mật độ tế bào (CFU/ml hoặc Cell/ml) X: giá trị OD ở bƣớc sóng 600nm
Bƣớc 2: Xác định mật độ tế bào theo độ đục
Từ trị số OD600nm đo đƣợc, dựa vào đƣờng cong chuẩn giữa mật độ tế bào và độ đục OD600nm tính tốn đƣợc mật độ tế bào trong mẫu cần xác định.
2.5.3.2. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp trang cấy
Hai chủng VNC1, VNC53 sử dụng nguồn đƣờng của môi trƣờng trang cấy, phát triển thành khuẩn lạc, có khả năng phân biệt bằng mắt thƣờng.
Tiến hành: Hút 1ml mẫu (dịch huyền phù chứa vi sinh vật hay dịch lên men) vào ống nghiệm nút xoáy chứa 9ml dung dịch NaCl 0,85% pH 4,5, lắc đều cho vi sinh vật phân phối đều trong ống. Thực hiện tƣơng tự để có các hệ số pha loãng khác nhau.
Hút 0,1ml dung dịch huyền phù vào mỗi đĩa thạch, dùng que chang vô trùng trang đều lƣợng dịch huyền phù lên khắp mặt thạch. Mỗi nồng độ lặp lại ba lần trên đĩa thạch để lấy kết quả trung bình.
Các đĩa thạch đƣợc ni cấy trong 48-72h/ở 300C. Chọn các đĩa có số lƣợng khuẩn lạc khoảng 25 đến 250 để lấy kết quả tính tốn.
Mật độ tế bào (CFU/ml) = ×Di Trong đó:
Ai: số lƣợng khuẩn lạc trung bình trong 2 đĩa ở cùng nồng độ pha lỗng Vi: Thể tích dịch huyền phù trang cấy (ml)
Di: Hệ số pha loãng