Nhóm Ký hiệu chủng Cảm quan
Lactococcus
ƣa ấm
M11 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M12 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M21 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M31 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M32 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M33 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M34 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. VNC1 Thơm, mùi bơ, sữa, chua dịu. VNC2 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. VNC3 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. VNC53 Thơm, mùi bơ, sữa, chua dịu.
Streptococcus
ƣa nhiệt
T11 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua T12 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua
M12 T12 T14 M21 T21 T11 VNC2 VNC 1 VNC3 M33
Nhóm Ký hiệu chủng Cảm quan
T14 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua T15 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua T21 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua T31 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua VNY3 Thơm, mùi sữa, thoảng mùi chua
3.2. Tuyển chọn chủng giống, định tên và lập hồ sơ chủng giống
Trong hỗn hợp chủng giống khởi động, nhà sản xuất thƣờng phối trộn các chủng ƣa ấm và ƣa nhiệt nhằm mục đích: Tăng thời gian sử dụng sản phẩm, đẩy nhanh q trình đơng tụ sữa và hạn chế sự nhạy cảm của các thực khuẩn. Căn cứ vào các đặc điểm đã khảo sát, đề tài đã tuyển chọn ra hai chủng ƣa ấm Lactococcus
VNC1 và VNC53 cùng vớ i mô ̣t chủng ƣa nhiê ̣t Streptococcus VNY3 để lập hồ sơ
chủng giống.
3.2.1. Định danh chủng
Để định danh chủng, thực hiện tách ADN, đoạn gen mã hóa cho 16S rADN đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả từ hình cho thấy đã khuếch đại thành cơng đoạn gen 16S rDNA của 3 mẫu phân tích. Đoạn gen có kích thƣớc nhƣ mong đợi khoảng 1,4 kb (Hình 3.2).
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và đƣợc giải trình tự đoạn gen 16S rADN. Kết quả đã thu đƣợc trình tự của từng chủng nhƣ trình bày trong phần phụ lục. Các trình tự này đã đƣợc sử dụng để tiến hành chạy Blastn trên ngân hàng dữ liệu Genbank NCBI, cho phép nhận diện loài trong mẫu nghiên cứu dựa vào độ tƣơng đồng trong cấu trúc trình tự 16S rADN.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rADN của 3 chủng LAB Kết quả so sánh trình tự trên GenBank cho thấy: trình tự 16s rADN của VNC1 Kết quả so sánh trình tự trên GenBank cho thấy: trình tự 16s rADN của VNC1 có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự có SĐK KT261215, KR265147, KT261212..., trình tự 16s rADN của VNC53 có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự có SĐK AB68129, NR074949, KJ531389..., trình tự 16s rADN của VNY3 có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự có SĐK HM058749, HM058894, FR725449...
Sử dụng các trình tự 16S rADN đã xác định đƣợc của các chủng nghiên cứu và các trình tự tƣơng đồng 100% với chúng trên GenBank, tiến hành căn trình tự và so sánh trình tự đa chuỗi sử dụng phần mềm ClustalX2 2.0. Sau đó xây dựng cây phát sinh loài bằng phƣơng pháp Neighbour-Joining với trị số Bootstrap 100.
Từ kết quả phân tích cây phát sinh lồi (Hình 3.3) và so sánh tƣơng đồng trình tự 16S rADN, đề tài đã định danh đƣợc chủng VNC1 thuộc loài phụ
Lactococcus lactis subsp. lactis, chủng VNC53 thuộc loài phụ Lactococcus lactis subsp. cremoris và chủng VNY3 thuộc loài Streptococcus thermophilus.
Hình 3.3. Cây phát sinh lồi của LAB dựa vào trình tự nucleotide 16S rADN. 3.2.2. Khả năng sử dụng các nguồn đƣờng
Phổ sử dụng các loại đƣờng của chủng khởi động là một đặc điểm cần đƣợc mơ tả. Điều này có ý nghĩa trong việc nghiên cứu kết hợp chủng để tạo hỗn hợp giống khởi động và công nghệ lên men tạo sinh khối của mỗi chủng. Do đó, tiến hành khảo sát khả năng sử dụng 49 loại đƣờng khác nhau theo bộ kit API 50CHL. Sinh khối của mỗi chủng thu từ đĩa thạch, đƣợc tái huyền phù trong ống Suspension Medium của bộ kit, để đạt đƣợc độ đục là 2 McFarland. Sau đó, dịch này đƣợc nhỏ vào các giếng trên bộ kit để kiểm tra khả năng sử dụng đƣờng. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.5:
Kết quả trên cho thấy, chủng VNC1, VNC53 có phổ sử dụng nguồn đƣờng rộng. Trong đó, sử dụng tốt các loại đƣờng galactose, glucose, fructose, mannose, N – Acetyl – Glucosamine, lactose, trehalose, gentiobiose. Trong khi đó, chủng VNY3 chỉ lên men đƣợc glucose và lactose. Chủng VNY3 sử dụng đƣợc lactose nhƣng
không sử dụng đƣợc galactose, do vậy, galactose giải phóng ra từ lactose đƣợc tích tụ trong mơi trƣờng. Trong khi đó, chủng VNC1 và VNC53 sử dụng tốt galactose. Khi kết hợp chủng ƣa ấm và ƣa nhiệt này để lên mem sữa thì sẽ khơng có sự cạnh tranh về dinh dƣỡng. Hơn nữa, sự kết hợp này còn tạo ra ƣu điểm là sử dụng triệt để các nguồn đƣờng, hạn chế sự phát triển của hệ vi sinh vật khơng đóng vai trị là giống khởi động.